絕對(duì)計(jì)數(shù)在流式檢測(cè)中是我們檢測(cè)的重要指標(biāo)之一，定義是單位體積樣本（如血液樣本）中，含有某種類別細(xì)胞的數(shù)目。常用的絕對(duì)計(jì)數(shù)的方法有：雙平臺(tái)法和單平臺(tái)法，單平臺(tái)法絕對(duì)計(jì)數(shù)主要分為微球法和直接體積法。雙平臺(tái)法操作繁瑣和誤差大等原因，應(yīng)用較少，目前市場(chǎng)上絕對(duì)計(jì)數(shù)以單平臺(tái)法為主。應(yīng)用領(lǐng)域：淋巴亞群、HIV免疫檢測(cè)、菌群、藻類等項(xiàng)目的絕對(duì)計(jì)數(shù)。

 

微球法絕對(duì)計(jì)數(shù)：

       

 

微球法是流式細(xì)胞術(shù)中最早用來開展單平臺(tái)絕對(duì)計(jì)數(shù)的方法，目前被廣泛使用和認(rèn)可。用絕對(duì)計(jì)數(shù)微球來計(jì)算混合復(fù)雜的細(xì)胞群體中（如血樣）目的細(xì)胞群的絕對(duì)細(xì)胞數(shù)量的。絕對(duì)計(jì)數(shù)微球是4 - 10 μm的熒光微球，可以被市面上幾乎所有的流式常用的激發(fā)光激發(fā)（具體根據(jù)廠家說明書）。層浪開發(fā)的ModelFlower流式軟件，內(nèi)置微球法絕對(duì)計(jì)數(shù)算法，無需人工計(jì)算可直接得出圈內(nèi)目的細(xì)胞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)值。計(jì)算公式為：

 

樣本準(zhǔn)備流程：

 

1. 反吸法取50 μl抗凝全血加入TruCount Tubes內(nèi);

2. 加入抗體染色，CD45 - PerCp，CD3 - Violet610，CD4 - FITC，根據(jù)說明書每個(gè)抗體加入5 μl，室溫避光孵育20 min（抗體用量和孵育時(shí)間根據(jù)說明書建議）;

3. 直接入加入435 μl紅細(xì)胞裂紅液（總體系500 μl），因抗體量不同有所差異），室溫避光孵育15 min（不同廠家可調(diào)整孵育時(shí)間）；

4. 直接上機(jī)檢測(cè)；

5. 設(shè)置條件，圈Beads門，微球總數(shù)，以及樣本體積，軟件可以自動(dòng)計(jì)算圈出的淋巴亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)值，無需人工計(jì)算（單位：個(gè) / μl）。

 

圖1. 微球法絕對(duì)計(jì)數(shù)條件設(shè)置

 

檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析結(jié)果：

 

圖2. 微球法絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果

 

圖示：圖A為CD45和SSC圈出淋巴細(xì)胞群，右上角為絕對(duì)計(jì)數(shù)微球的信號(hào)；絕對(duì)計(jì)數(shù)微球的圈門通常用FITC和PE雙參數(shù)，如圖B所示；從圖A中的Lym群，圈CD3的信號(hào)，如圖C所示；然后再從CD3門中圈出CD3+CD4+的信號(hào)，如圖D所示；圖E展示各個(gè)細(xì)胞群的顆粒數(shù)、百分比（%Parent）和微球法絕對(duì)計(jì)數(shù)（絕對(duì)計(jì)數(shù)-B）的結(jié)果。

 

體積法絕對(duì)計(jì)數(shù)：

       

 

體積法絕對(duì)計(jì)數(shù)計(jì)算公式為：細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量（個(gè)/μl）=N（圈內(nèi)總的細(xì)胞數(shù)）/V(上樣體積）。市面上體積法絕對(duì)計(jì)數(shù)的流式細(xì)胞儀有蠕動(dòng)泵和注射泵兩種，其中蠕動(dòng)泵容易發(fā)生形變，可能影響計(jì)數(shù)的結(jié)果，要求時(shí)常更換蠕動(dòng)泵；而注射泵相比蠕動(dòng)泵，不用考慮形變問題，而且注射泵勻速推動(dòng)樣本上樣，上樣更穩(wěn)定，以及對(duì)體積的計(jì)算更加準(zhǔn)確。

 

樣本準(zhǔn)備流程：

 

1. 反向吸樣取50 μl抗凝全血加入流式管內(nèi);

2. 加入抗體染色，CD45 - PerCp，CD3 - Violet610，CD4 - FITC，根據(jù)說明書每個(gè)抗體加入5 μl，室溫避光孵育20 min（抗體用量和孵育時(shí)間根據(jù)說明書建議）;

3. 直接加入435 μl紅細(xì)胞裂紅液（總體系500 μl），因抗體量不同有所差異），室溫避光孵育15 min（不同廠家可調(diào)整孵育時(shí)間）；

4. 直接上機(jī)檢測(cè)；

5. 設(shè)置絕對(duì)計(jì)數(shù)條件，設(shè)置檢測(cè)樣本稀釋倍數(shù)（10倍），統(tǒng)計(jì)區(qū)可直接獲得體積法絕對(duì)計(jì)數(shù)的結(jié)果。

 

圖3. 體積法絕對(duì)計(jì)數(shù)條件設(shè)置

 

檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析結(jié)果：

 

圖4. 體積法絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果

 

圖示：圖A為CD45和SSC圈出淋巴細(xì)胞群；從圖A中的Lym群，圈CD3的信號(hào)，如圖B所示；然后再從CD3門中圈出CD3+CD4+的信號(hào)，如圖C所示；圖D展示各個(gè)細(xì)胞群的顆粒數(shù)、百分比（%Parent）和體積法絕對(duì)計(jì)數(shù)（絕對(duì)計(jì)數(shù)-V）的結(jié)果。

 

微球法和體積法一致性分析，同時(shí)使用體積法和微球法兩種方法對(duì)淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的一致性進(jìn)行分析（n = 10），如圖5所示。兩種方法檢測(cè)的相關(guān)系數(shù)R²為0.9928，接近1，表明兩種絕對(duì)計(jì)數(shù)檢驗(yàn)方法一致性較好。

 

 

圖5. 體積法和微球法一致性檢測(cè)

 

總結(jié)：

層浪流式細(xì)胞儀既可以微球法（免計(jì)算），又兼容體積法絕對(duì)計(jì)數(shù)。對(duì)比微球法和體積法絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果，Lym、CD3、CD3+CD4+的絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果基本一致，層浪流式細(xì)胞儀支持微球法和體積法對(duì)粒子進(jìn)行絕對(duì)計(jì)數(shù)。層浪體積法絕對(duì)計(jì)數(shù)的優(yōu)勢(shì)：結(jié)果精確，依賴于精準(zhǔn)的柱塞泵吸樣模式；節(jié)約成本，無需額外購買絕對(duì)計(jì)數(shù)微球；耗材損耗小，無需頻繁更換蠕動(dòng)泵管；針對(duì)小顆粒菌群、藻類的檢測(cè)，有更可靠的準(zhǔn)確性。

 

 

關(guān)于層浪生物

 

層浪聚焦流式細(xì)胞領(lǐng)域，致力于實(shí)現(xiàn)流式技術(shù)系統(tǒng)化、自動(dòng)化、智能化，在臨床領(lǐng)域推動(dòng)流式技術(shù)的常規(guī)化，在科研領(lǐng)域推進(jìn)國產(chǎn)流式高端化。目前已推出多款流式產(chǎn)品：2激光8色流式細(xì)胞儀于2021年初成功獲得NMPA注冊(cè)證；高端產(chǎn)品科研型3激光14色流式細(xì)胞儀FongCyte™上市一年，儀器性能獲得客戶的高度認(rèn)可；高端產(chǎn)品臨床型3激光14色流式細(xì)胞儀LongCyte™26種型號(hào)均獲CE認(rèn)證。公司核心團(tuán)隊(duì)均在流式技術(shù)領(lǐng)域有10余年經(jīng)驗(yàn)，十年如一日專注流式技術(shù)研究，致力于研發(fā)生產(chǎn)穩(wěn)定、可靠、性能優(yōu)異的產(chǎn)品。層浪未來將陸續(xù)推出更多高端流式產(chǎn)品，為中國的流式技術(shù)發(fā)展盡綿薄之力，做行業(yè)中流式技術(shù)普及者，做客戶信賴的流式伙伴，為中國的臨床和科研事業(yè)助飛。