精原干細胞移植(Spermatogonial stem cell transplantation,SSCT)被提議作為兒童癌癥幸存者的生育療法。SSCT首先冷凍保存睪丸活檢,然后再進行性腺毒性治療(如癌癥治療)。當兒童癌癥幸存者成年并想要親生孩子時,可以將活檢組織解凍并在體外增殖精原干細胞(SSC),隨后將其自動移植回睪丸。然而,長期增殖過程中的培養(yǎng)應激可能會導致SSC的表觀遺傳學變化,如DNA甲基化變化,并可能遺傳給SSCT后出生的子代。因此,在臨床實施這種新型細胞療法之前,SSCT需要對衍生子代進行詳細的臨床前表觀遺傳學評估。
2023年04月07日,荷蘭阿姆斯特丹大學UMC生殖醫(yī)學中心生殖生物學實驗室Callista L Mulder團隊在《Clin Epigenetics》雜志發(fā)表了題為“Sperm DNA methylation is predominantly stable in mice offspring born after transplantation of long-term cultured spermatogonial stem cells”的研究論文,該研究通過使用簡化甲基化測序(RRBS)在多代小鼠模型中研究了SSCT衍生子代具有體外增殖SSC精子的DNA甲基化狀態(tài)。
標題:Sperm DNA methylation is predominantly stable in mice offspring born after transplantation of long-term cultured spermatogonial stem cells在長期培養(yǎng)的精原干細胞移植后出生的小鼠后代中,精子DNA甲基化水平穩(wěn)定
時間:2023.04.07
期刊:Clinical Epigenetics
影響因子:IF 7.259
技術平臺:RRBS、BSP、RT-qPCR等
樣本實驗:
研究設計:SSCT子代的多代小鼠模型
F0:移植小鼠,F1:SSCT后出生的第一代,F2:SSCT后親本出生的第二代,F2/M:F2由母系產生,F2/P:F2由父系產生。從代際子代的5只雄性小鼠采集附睪精子,比較DNA甲基化狀態(tài)(F0的n=3,F1和F2的每個子代亞組n=5)
研究結果:
通過對第一代和第二代SSCT出生小鼠子代的精子進行RRBS DNA甲基化測序分析,以此來評估SSCT衍生子代的分子表觀遺傳穩(wěn)定性,并將其與對照組精子進行比較分析。研究結果表明,在所有子代中,DNA甲基化差異比例占總CpG和甲基化區(qū)域不到0.5%。所有樣品的無監(jiān)督聚類分析沒有顯示出基于甲基化差異模式的明顯分組。對與對照組相比在多代SSCT子代中顯著變化的少數單個基因用定量亞硫酸鹽Sanger測序(BSP)和RT-qPCR在不同器官中進行了驗證。僅Tal2的差異甲基化得到證實,與對照F1相比,Tal2在SSCT子代的精子中低甲基化,且在SSCT F1子代的卵巢中表現出更高的基因表達。表明在F1代和F2代精子中,SSCT衍生的子代和對照組之間的DNA甲基化沒有顯著差異。
研究圖表:
圖1:所有樣品平均甲基化的無監(jiān)督聚類熱圖。
所有樣本的熱圖聚類基于每個樣本之間的顯著差異甲基化(F0 n=3在,F1和F2 子代亞組n=5)和所有樣品的平均甲基化(duplo),熱圖中包括前500個變化最大的DMR(高甲基化和低甲基化)的中淺灰色的最后2行
表1:對照組F0/對照組F1與SSCT組/SSCT亞組之間顯著差異的所有DMC和DMR
圖2:與對照組F1相比,SSCT F1和SSCT F2的CpG位點的差異分析(DMC)。
- 火山圖顯示了SSCT樣品和對照樣品之間CpG甲基化模式變化的CpG數量,顯著高于或低于25%差異截止值并考慮了q值閾值為0.01。x軸和y軸上的值分別是校正后p值的甲基化差異百分比和-log10。
- 代際間的差異甲基化CpG(DMC)在DNA區(qū)域外顯子、內含子、啟動子和基因間區(qū)域的分布。
圖3:與對照F1相比,SSCT F1和SSCT F2子代的DMR差異分析。
- 火山圖顯示了SSCT樣品和對照樣品之間甲基化模式改變的DMR數量。
- DNA區(qū)域外顯子、內含子、啟動子和基因間區(qū)域的差異甲基化區(qū)域(DMR)分布。
表2:在SSCT F0、SSCT F1和SSCT F2代際之間的外顯子和啟動子區(qū)域中共有的DMR變化基因(粗體字體),這些基因將進一步驗證
圖4:對單個精子樣本的Tal2基因的RRBS結果進行BSP驗證。整體CpG平均值如下:對照F1 24.7%±4.4%、SSCT F1 17.4%±4.5%、SSCT F2/M 22.7%±9.3%、SSCT F2/P 14.5%±3.2%表現出SSCT和對照之間甲基化差異最大(10%)。
圖5:RT-qPCR比較Tal2基因表達分析
F1、F2/M和F2/P中對照組F1和SSCT子代之間的睪丸(A)、卵巢(B)和腎(C)的平均表達率。條形圖和ANOVA的統(tǒng)計分析以及Tukey事后檢驗代表了代際組之間的RNA表達,(每個器官n=5,F1和F2中的每個子代亞組,在技術三倍體中進行RT-PCR)*兩組間觀察到統(tǒng)計學顯著差異(p < 0.05)。
參考文獻:
Serrano JB, Tabeling NC, de Winter-Korver CM, van Daalen SKM, van Pelt AMM, Mulder CL. Sperm DNA methylation is predominantly stable in mice offspring born after transplantation of long-term cultured spermatogonial stem cells. Clin Epigenetics. 2023 Apr 7;15(1):58.