代謝組學的主要目的是研究有機體在特定時間和空間下所表達的小分子代謝物的組成及含量變化，從而尋找代謝物與表型變化的相對關系。
為了幫助大家快速了解代謝組學，小 M 今日特地挑選了代謝組學中應用最為廣泛也是最經典的 LC-MS 技術來解鎖代謝組學實驗篇，研究過程可分為研究設計、樣本準備、儀器檢測和數(shù)據(jù)分析 4 個主要步驟 (圖 1)^[1]。

 

 

圖 1. LC-MS 代謝組學的一般流程圖^[2]。

一個包含四個重要階段的 notame 工作流的總體概述

 

 

■ Part 1：研究設計

Q：代謝組學出現(xiàn)在生命科學的各個研究領域中，paper 更是數(shù)不勝數(shù)，我該如何開始設計呢

A：代謝組學更像一種研究技術和方法，實驗設計有 2 個關鍵內容，小 M 給大家列出來了。

 

1. 明確科學問題并選擇合適的代謝組學技術：明確研究的科學問題及目標代謝物，選擇合適的檢測技術，對后續(xù)的研究能起到很好的指導作用。

 

表 1. 代謝組學技術選擇

 

2. 樣本選擇與設計

樣本的選擇通常是個性化的，需要依照具體的研究背景和目的進行選擇，而樣本設計則有一定的共性：

1）由于代謝組定量一般是相對定量，所以需要設置實驗組及對照組

2）每組樣本需要設置有生物學重復

 

■ Part 2：樣本準備
接下來終于要開始動手做實驗啦，由于代謝物會發(fā)生氧化降解，所有實驗步驟都需要冰上進行或者低溫操作~
1. 樣本收集與保存：首先各位小伙伴要依據(jù)研究背景及實驗設計，收集并處理樣本，常規(guī)樣本 (細胞等) 經 PBS 清洗后 4℃ 離心取沉淀，液體樣本冷凍離心后取上清，并轉到 EP 管中凍存于 -80℃ 冰箱。
2. 代謝物提取：每樣本加入 1 mL 預冷的提取試劑，震蕩后液氮速凍、超聲，低溫孵育 1 h 以上，隨后冷凍離心取上清，這一步的目的是充分沉淀蛋白質并提取代謝物。接下來收集上清液凍干并加入 100 µL 復溶劑，充分溶解后冷凍離心取上清轉至 LC-MS 樣本瓶待測 (圖 2)。
3. QC (Quality Control) 樣本準備：每樣本中取出 10 µL 混合成 QC 樣本。

 

圖 2. 血漿樣本代謝組提取過程示例^[3]

 

■ Part 3：儀器檢測

LC-MS 檢測儀器多種多樣，小伙伴可以根據(jù)研究設計與實驗條件自行選擇。除了需要選擇合適的儀器和方法外，還有兩點要注意：

 

1.  樣本檢測順序需隨機打亂，檢測前后需插入空白溶劑樣本及 QC 樣本，同時 QC 樣本也需插入樣本序列進行檢測，用于柱平衡、質控、并輔助后續(xù)的數(shù)據(jù)分析^[4]。
2.  除了實驗方法、儀器設備及參數(shù)存在差異，質譜儀的信號也會隨時間發(fā)生偏移，即使質譜儀可以定期校準，但我們仍然建議需進行比較的樣本組要同一批次上機檢測。

■ Part 4：數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)分析可謂是代謝組學研究的 “關鍵限速步驟” (圖 3)，我們可以將它分解成 4 個步驟來完成：
1. 原始數(shù)據(jù)處理：通過基線校正、峰對齊、峰識別、缺失值填充、數(shù)據(jù)過濾、歸一化處理等方式將原始數(shù)據(jù)中的代謝物信息進行提取并轉換成可用于數(shù)據(jù)分析的形式。
2. 統(tǒng)計分析：主要包含單統(tǒng)計分析 (Fold change、T test、Volcano Plot 等) 及多統(tǒng)計分析 (PCA、HCA、PLS-DA 等)，也可輔以機器學習建模的方法，一般是通過尋找差異表達的代謝物從而鎖定與研究背景相關的目標物質。
3. 代謝物鑒定：

目的是將 LC-MS 檢測信號匹配到對應代謝物，分為標準品數(shù)據(jù)庫比對和算法預測兩種方式^[5]。

4. 功能分析："萬里長征" 的最后一步，把結果解析好是代謝組的點睛之筆。然而要將功能注釋做得盡善盡美，通常還需要結合文獻調研與后續(xù)實驗來確認。不過我們可以先通過通路鑒定，GESA 分析，通路富集分析，網絡分析等分析方法找到關鍵代謝通路與代謝物作為功能分析的切入點。

 

圖 3. 代謝組學數(shù)據(jù)分析流程^[6]

典型的代謝組學數(shù)據(jù)分析工作流程，包括數(shù)據(jù)原始處理、統(tǒng)計分析、功能注釋等過程。

 

以上就是一次經典的代謝組學的全部實驗流程啦，上期小 M 介紹了代謝組的基本知識和經典案例，錯過的同學們可以看一看~

您是不是已經迫不及待的想要開始自己的代謝組學實驗呢？小 M 為大家?guī)�來�?MCE 代謝組學服務，主要包括非靶向代謝組學和靶向代謝組學兩大類，且有專業(yè)的代謝組學技術團隊為您提供從樣品處理到生信分析的一站式服務！

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參考文獻

 

 

 

1. Mahmud, Iqbal, et al. "Decoding the metabolome and lipidome of child malnutrition by mass spectrometric techniques: present status and future perspectives." Analytical chemistry 91.23 (2019): 14784-14791.

2. Klåvus, Anton, et al. "“Notame”: Workflow for non-targeted LC–MS metabolic profiling." Metabolites 10.4 (2020): 135.

3. Chan, C. Y., et al. "Technology platform development for targeted plasma metabolites in human heart failure." Clinical proteomics 10.1 (2013): 1-9.

4.  Broadhurst, David, et al. "Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies." Metabolomics 14.6 (2018): 1-17.

5. Wandy, Joe, et al. "In silico optimization of mass spectrometry fragmentation strategies in metabolomics." Metabolites 9.10 (2019): 219.

6. Chong, Jasmine, Mai Yamamoto, and Jianguo Xia. "MetaboAnalystR 2.0: from raw spectra to biological insights." Metabolites 9.3 (2019): 57.
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