EZH2調(diào)節(jié)皮膚再生與機(jī)械拉伸持續(xù)時(shí)間之間的相關(guān)性
醫(yī)學(xué)和社會(huì)都迫切需要改進(jìn)重大皮膚受損或缺陷的治療方法。自 1982 年以來(lái)，通過(guò)持續(xù)的機(jī)械拉伸（3-5個(gè)月）誘導(dǎo)皮膚再生，皮膚組織擴(kuò)張已被證明是一種有效和必要的皮膚缺損治療方法。機(jī)械拉伸及其如何誘導(dǎo)細(xì)胞增殖一直是一個(gè)熱門(mén)話題。信號(hào)換能器，如MAPK、整合素、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1/2 和蛋白激酶 B 被發(fā)現(xiàn)在角質(zhì)形成細(xì)胞中被短期（不超過(guò)7天）機(jī)械刺激激活。研究表明，主要的轉(zhuǎn)錄因子YAP被證明可以在各種細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)械信號(hào)，是控制表皮增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。然而，關(guān)于長(zhǎng)期（LT）機(jī)械拉伸對(duì)濾泡間表皮干細(xì)胞（IFESC）激活和增殖的影響知之甚少。但上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，皮膚再生與機(jī)械拉伸持續(xù)時(shí)間之間存在一種意想不到的相關(guān)性。
機(jī)械拉伸對(duì)IFESCs增殖的調(diào)控具有時(shí)間依賴性
實(shí)驗(yàn)首先研究機(jī)械拉伸（0.5HZ，10%伸長(zhǎng)率）對(duì)皮膚再生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短期（1個(gè)月）機(jī)械拉伸促進(jìn)了表皮增殖，拉伸的表皮基底細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原和p63（表皮增殖細(xì)胞標(biāo)志物）、角蛋白（K）5、K14和K15（表皮基底細(xì)胞標(biāo)志物）的免疫染色增加（圖1 a、b）。然而，LT拉伸（5個(gè)月）導(dǎo)致增殖細(xì)胞核抗原、K5、K14和p63 的免疫染色降低（圖1 a、b）。這項(xiàng)臨床研究的結(jié)果表明，機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的皮膚再生具有時(shí)間相關(guān)性。
接下來(lái)，研究人員在體外IFESCs中建立了一個(gè)LT拉伸模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在72小時(shí)內(nèi)，機(jī)械拉伸比未拉伸對(duì)照組引起的增殖率更高，這與之前的報(bào)告一致。然而，IFESCs的細(xì)胞增殖和集落形成能力在7周后顯著降低（圖1 c、d），K5和ΔNP63的表達(dá)也降低（圖1 e-g）。以上結(jié)果清楚地證明了機(jī)械拉伸持續(xù)時(shí)間對(duì)皮膚再生的兩種不同影響，即短期與LT效應(yīng)。
研究推測(cè)，LT機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)停滯可能歸因于機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的表觀遺傳修飾。為了測(cè)試這一點(diǎn)，需要鑒定IFESCs中機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶基因。YAP被證明可以在表皮中轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)械信號(hào)，不同的刺激對(duì)生長(zhǎng)的調(diào)控也是通過(guò)不同的YAP靶基因?qū)崿F(xiàn)的，即使在單細(xì)胞類型中。因此，首先確定了YAP在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中的靶基因。結(jié)果表明，只有KLHL21敲低顯著抑制了由機(jī)械力學(xué)而不是其他基因誘導(dǎo)的IFESCs的增殖，而且KLHL21與IFESCs增殖呈正相關(guān)。YAP或KLHL21的抑制都可以顯著抑制IFESCs在體內(nèi)的增殖。此外，還分析了YAP和KLHL21在體外LT機(jī)械拉伸過(guò)程中的蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YAP和KLHL21在拉伸1周后增加，但在7周拉伸后恢復(fù)到與基礎(chǔ)水平相似的水平。這些結(jié)果表明，短期機(jī)械拉伸能夠觸發(fā)YAP的激活和核積累，誘導(dǎo)KLHL21的表達(dá)，從而促進(jìn)IFESCs的增殖。
LT機(jī)械拉伸增加H3K27me3修飾
接下來(lái)，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了YAP靶基因的表觀遺傳狀態(tài)。有趣的是，在LT拉伸組中，在靶基因之一EGR3的基因體中，兩個(gè)位點(diǎn)被鑒定為高甲基化。在排除DNA甲基化后，研究了組蛋白H3K27的三甲基化狀態(tài)（組蛋白H3K27位點(diǎn)的三甲基化被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄抑制的標(biāo)志）。在體外發(fā)現(xiàn)，LT拉伸顯著提高了KLHL21啟動(dòng)子中的H3K27me3水平（圖2 c）。在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，拉伸5個(gè)月的表皮基底細(xì)胞中KLHL21啟動(dòng)子中的H3K27me3顯著升高（圖2 d）。因此，測(cè)試了已知控制H3K9或H3K27甲基化的各種賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的表達(dá)。在檢查的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶中，H3K27me3表觀遺傳調(diào)控因子PRC2的催化亞基EZH2在LT拉伸的IFESCs中增加。與用于H3K4或H3K30的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶相比，在IFESCs中，只有EZH2被LT拉伸上調(diào)（圖2 e、f）。這些結(jié)果表明，LT機(jī)械拉伸增加了EZH2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)了表觀遺傳修飾（H3K27me3）。而這是否是LT機(jī)械拉伸導(dǎo)致IFESCs生長(zhǎng)停滯的原因，還有待研究。
EZH2過(guò)表達(dá)抑制IFESC增殖
為了測(cè)試上述疑問(wèn)，實(shí)驗(yàn)在IFESCs中過(guò)度表達(dá)了EZH2。EZH2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致EZH2和H3K27me3表達(dá)增加，KLHL21表達(dá)降低（圖3 a、b）。實(shí)驗(yàn)還通過(guò)抑制集落形成能力（圖3 c）和細(xì)胞增殖（圖3 d）觀察到了同樣預(yù)期結(jié)果。此外，在EZH2過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，短期拉伸誘導(dǎo)的YAP核易位也減少（圖3 e、f）。熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定表明，當(dāng)EZH2過(guò)表達(dá)時(shí)，組成型活化的YAPS127A 與 KLHL21啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合被阻斷（圖3 g）。這些結(jié)果證實(shí)了，EZH2的過(guò)表達(dá)抑制了IFESC的增殖。
抑制EZH2挽救LT機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的生長(zhǎng)停滯
EZH2的藥理學(xué)抑制劑—GSK343，用于測(cè)試抑制EZH2是否能挽救LT機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的IFESC生長(zhǎng)停滯。體外實(shí)驗(yàn)表明，GSK343對(duì)YAP、KLHL21和EZH2的蛋白表達(dá)沒(méi)有影響（圖4 a）。LT機(jī)械拉伸降低了YAP的核易位，并且在GSK343干預(yù)后明顯阻斷了這種效應(yīng)（圖4 b、c）。此外，GSK343（1μM，7周）降低了H3K27me3水平（圖4 d），并挽救了LT拉伸后IFESCs中降低的KLHL21表達(dá)（圖4 e）和集落形成能力（圖4 f）。在體內(nèi)，GSK343皮內(nèi)注射（10μM，4周）導(dǎo)致表皮厚度增加（圖4 g），K14和ΔNP63表達(dá)增加，并減少每毫米表皮毛囊數(shù)量（圖4 h）。免疫熒光染色顯示，GSK343誘導(dǎo)了更多的K5- 和P63- 陽(yáng)性基底細(xì)胞，表皮厚度增加（圖4 i）。這些體外和體內(nèi)研究表明，EZH2抑制劑可以抑制H3K27me3的形成，挽救IFESCs的增殖停滯。這些闡明了LT機(jī)械拉伸可以增加EZH2表達(dá)，從而誘導(dǎo)表觀遺傳修飾（H3K27me3），這就是LT機(jī)械拉伸導(dǎo)致IFESC生長(zhǎng)停滯的原因（圖4 j）。
綜上所述，這項(xiàng)研究表明，干細(xì)胞增殖與EZH2調(diào)控的機(jī)械拉伸持續(xù)時(shí)間之間存在意想不到的相關(guān)性。這項(xiàng)誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯的長(zhǎng)期機(jī)械拉伸的研究為臨床轉(zhuǎn)化促進(jìn)皮膚再生提供了一種策略。
參考文獻(xiàn)：Wang J, Zhang Y, Gao Y, Shan S, Li Q. EZH2 Regulates the Correlation between Skin Regeneration and the Duration of Mechanical Stretch. J Invest Dermatol. 2021 Apr;141(4):894-902.e9. doi: 10.1016/j.jid.2020.09.007. Epub 2020 Oct 16. PMID: 33069730.
小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請(qǐng)聯(lián)系小編修正。
微信搜索公眾號(hào)“Naturethink”，了解更多細(xì)胞體外仿生培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用。
機(jī)械拉伸對(duì)IFESCs增殖的調(diào)控具有時(shí)間依賴性
實(shí)驗(yàn)首先研究機(jī)械拉伸（0.5HZ，10%伸長(zhǎng)率）對(duì)皮膚再生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短期（1個(gè)月）機(jī)械拉伸促進(jìn)了表皮增殖，拉伸的表皮基底細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原和p63（表皮增殖細(xì)胞標(biāo)志物）、角蛋白（K）5、K14和K15（表皮基底細(xì)胞標(biāo)志物）的免疫染色增加（圖1 a、b）。然而，LT拉伸（5個(gè)月）導(dǎo)致增殖細(xì)胞核抗原、K5、K14和p63 的免疫染色降低（圖1 a、b）。這項(xiàng)臨床研究的結(jié)果表明，機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的皮膚再生具有時(shí)間相關(guān)性。
接下來(lái)，研究人員在體外IFESCs中建立了一個(gè)LT拉伸模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在72小時(shí)內(nèi)，機(jī)械拉伸比未拉伸對(duì)照組引起的增殖率更高，這與之前的報(bào)告一致。然而，IFESCs的細(xì)胞增殖和集落形成能力在7周后顯著降低（圖1 c、d），K5和ΔNP63的表達(dá)也降低（圖1 e-g）。以上結(jié)果清楚地證明了機(jī)械拉伸持續(xù)時(shí)間對(duì)皮膚再生的兩種不同影響，即短期與LT效應(yīng)。
研究推測(cè)，LT機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)停滯可能歸因于機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的表觀遺傳修飾。為了測(cè)試這一點(diǎn)，需要鑒定IFESCs中機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶基因。YAP被證明可以在表皮中轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)械信號(hào)，不同的刺激對(duì)生長(zhǎng)的調(diào)控也是通過(guò)不同的YAP靶基因?qū)崿F(xiàn)的，即使在單細(xì)胞類型中。因此，首先確定了YAP在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中的靶基因。結(jié)果表明，只有KLHL21敲低顯著抑制了由機(jī)械力學(xué)而不是其他基因誘導(dǎo)的IFESCs的增殖，而且KLHL21與IFESCs增殖呈正相關(guān)。YAP或KLHL21的抑制都可以顯著抑制IFESCs在體內(nèi)的增殖。此外，還分析了YAP和KLHL21在體外LT機(jī)械拉伸過(guò)程中的蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YAP和KLHL21在拉伸1周后增加，但在7周拉伸后恢復(fù)到與基礎(chǔ)水平相似的水平。這些結(jié)果表明，短期機(jī)械拉伸能夠觸發(fā)YAP的激活和核積累，誘導(dǎo)KLHL21的表達(dá)，從而促進(jìn)IFESCs的增殖。
圖1 機(jī)械拉伸對(duì)IFESCs增殖的時(shí)間依賴性調(diào)控。
LT機(jī)械拉伸增加H3K27me3修飾
接下來(lái)，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了YAP靶基因的表觀遺傳狀態(tài)。有趣的是，在LT拉伸組中，在靶基因之一EGR3的基因體中，兩個(gè)位點(diǎn)被鑒定為高甲基化。在排除DNA甲基化后，研究了組蛋白H3K27的三甲基化狀態(tài)（組蛋白H3K27位點(diǎn)的三甲基化被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄抑制的標(biāo)志）。在體外發(fā)現(xiàn)，LT拉伸顯著提高了KLHL21啟動(dòng)子中的H3K27me3水平（圖2 c）。在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，拉伸5個(gè)月的表皮基底細(xì)胞中KLHL21啟動(dòng)子中的H3K27me3顯著升高（圖2 d）。因此，測(cè)試了已知控制H3K9或H3K27甲基化的各種賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的表達(dá)。在檢查的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶中，H3K27me3表觀遺傳調(diào)控因子PRC2的催化亞基EZH2在LT拉伸的IFESCs中增加。與用于H3K4或H3K30的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶相比，在IFESCs中，只有EZH2被LT拉伸上調(diào)（圖2 e、f）。這些結(jié)果表明，LT機(jī)械拉伸增加了EZH2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)了表觀遺傳修飾（H3K27me3）。而這是否是LT機(jī)械拉伸導(dǎo)致IFESCs生長(zhǎng)停滯的原因，還有待研究。
圖2 LT機(jī)械拉伸誘導(dǎo)H3K27me3修飾。
EZH2過(guò)表達(dá)抑制IFESC增殖
為了測(cè)試上述疑問(wèn)，實(shí)驗(yàn)在IFESCs中過(guò)度表達(dá)了EZH2。EZH2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致EZH2和H3K27me3表達(dá)增加，KLHL21表達(dá)降低（圖3 a、b）。實(shí)驗(yàn)還通過(guò)抑制集落形成能力（圖3 c）和細(xì)胞增殖（圖3 d）觀察到了同樣預(yù)期結(jié)果。此外，在EZH2過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，短期拉伸誘導(dǎo)的YAP核易位也減少（圖3 e、f）。熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定表明，當(dāng)EZH2過(guò)表達(dá)時(shí)，組成型活化的YAPS127A 與 KLHL21啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合被阻斷（圖3 g）。這些結(jié)果證實(shí)了，EZH2的過(guò)表達(dá)抑制了IFESC的增殖。
圖3 EZH2過(guò)表達(dá)在體外抑制IFESC增殖。
抑制EZH2挽救LT機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的生長(zhǎng)停滯
EZH2的藥理學(xué)抑制劑—GSK343，用于測(cè)試抑制EZH2是否能挽救LT機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的IFESC生長(zhǎng)停滯。體外實(shí)驗(yàn)表明，GSK343對(duì)YAP、KLHL21和EZH2的蛋白表達(dá)沒(méi)有影響（圖4 a）。LT機(jī)械拉伸降低了YAP的核易位，并且在GSK343干預(yù)后明顯阻斷了這種效應(yīng)（圖4 b、c）。此外，GSK343（1μM，7周）降低了H3K27me3水平（圖4 d），并挽救了LT拉伸后IFESCs中降低的KLHL21表達(dá)（圖4 e）和集落形成能力（圖4 f）。在體內(nèi)，GSK343皮內(nèi)注射（10μM，4周）導(dǎo)致表皮厚度增加（圖4 g），K14和ΔNP63表達(dá)增加，并減少每毫米表皮毛囊數(shù)量（圖4 h）。免疫熒光染色顯示，GSK343誘導(dǎo)了更多的K5- 和P63- 陽(yáng)性基底細(xì)胞，表皮厚度增加（圖4 i）。這些體外和體內(nèi)研究表明，EZH2抑制劑可以抑制H3K27me3的形成，挽救IFESCs的增殖停滯。這些闡明了LT機(jī)械拉伸可以增加EZH2表達(dá)，從而誘導(dǎo)表觀遺傳修飾（H3K27me3），這就是LT機(jī)械拉伸導(dǎo)致IFESC生長(zhǎng)停滯的原因（圖4 j）。
圖4 抑制EZH2可挽救LT機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的生長(zhǎng)停滯。
綜上所述，這項(xiàng)研究表明，干細(xì)胞增殖與EZH2調(diào)控的機(jī)械拉伸持續(xù)時(shí)間之間存在意想不到的相關(guān)性。這項(xiàng)誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯的長(zhǎng)期機(jī)械拉伸的研究為臨床轉(zhuǎn)化促進(jìn)皮膚再生提供了一種策略。
參考文獻(xiàn)：Wang J, Zhang Y, Gao Y, Shan S, Li Q. EZH2 Regulates the Correlation between Skin Regeneration and the Duration of Mechanical Stretch. J Invest Dermatol. 2021 Apr;141(4):894-902.e9. doi: 10.1016/j.jid.2020.09.007. Epub 2020 Oct 16. PMID: 33069730.
小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請(qǐng)聯(lián)系小編修正。
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