在細(xì)胞基質(zhì)疫苗應(yīng)用領(lǐng)域，BHK細(xì)胞是常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系之一，其原始細(xì)胞株屬于貼壁依賴性生長(zhǎng)類型，經(jīng)馴化后可懸浮生長(zhǎng)^[1]。懸浮細(xì)胞更容易實(shí)現(xiàn)工藝放大，另外無(wú)血清培養(yǎng)基可提高疫苗產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性并降低生產(chǎn)成本^[2]。本文主要通過(guò) CloudReady^®云平臺(tái)生物反應(yīng)器建立BHK細(xì)胞無(wú)血清全懸浮培養(yǎng)工藝，為疫苗的高效及低成本生產(chǎn)提供工藝研究基礎(chǔ)。

方法與結(jié)果

反應(yīng)器：CloudReady^®（500 mL）云平臺(tái)生物反應(yīng)器
工作體積：300 mL
細(xì)胞：BHK（Baby Hamster Syrian Kidney）細(xì)胞
接種密度：4.5×10⁵ cells/mL
溫度控制：由半導(dǎo)體Peltier模塊的加熱和制冷實(shí)現(xiàn)無(wú)水控溫。
DO控制：由氧氣的通氣速率級(jí)聯(lián)控制，空氣恒通0.008 vvm（2.4 mL/min）。
pH控制：由二氧化碳的通氣速率和堿液（0.5 M NaOH）的流加速率級(jí)聯(lián)控制。
進(jìn)氣模式：底部通氣。

圖1 使用CloudReady^®進(jìn)行BHK細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)

本次實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)設(shè)置如表1所示。

表1 反應(yīng)器工藝參數(shù)

Day 0 ~ Day 5細(xì)胞密度及活率變化如圖2所示，最高活細(xì)胞密度（VCD）為1.56×10⁷ cells/mL，前期活率維持在98%以上。

圖2 細(xì)胞密度及活率變化曲線

在整個(gè)培養(yǎng)周期中，葡萄糖和乳酸濃度變化如圖3所示，谷氨酰胺和銨離子濃度及滲透壓變化如圖4所示。

圖3 葡萄糖和乳酸濃度變化曲線
圖4 谷氨酰胺和銨離子濃度及滲透壓變化曲線

隨著BHK細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，代謝產(chǎn)生大量乳酸，為維持pH值的恒定流加了大量堿液，另外補(bǔ)料和細(xì)胞代謝過(guò)程也導(dǎo)致體系滲透壓偏高，Day 5檢測(cè)上清液滲透壓值為398 mOsm，這也是后期細(xì)胞活率降低的原因之一。

由Day 5取樣鏡檢圖像（圖5）可見(jiàn)，BHK細(xì)胞高密度水平下仍保持單細(xì)胞均勻懸浮狀態(tài)，未出現(xiàn)結(jié)團(tuán)聚集等現(xiàn)象。

圖5 Day 5取樣鏡檢圖

結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用CloudReady^®進(jìn)行BHK細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)，最高活細(xì)胞密度（VCD）可達(dá)1.56×10⁷ cells/mL，前期活率維持在98%以上且細(xì)胞在高密度水平下仍可保持均勻懸浮狀態(tài)。驗(yàn)證了高通量微小型生物反應(yīng)器在疫苗工藝開(kāi)發(fā)與優(yōu)化方面應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)和適配性。

[1] Park S, Kim JY, Ryu KH, Kim AY, Kim J, Ko YJ, Lee EG. Production of a Foot-and-Mouth Disease Vaccine Antigen Using Suspension-Adapted BHK-21 Cells in a Bioreactor. Vaccines (Basel). 2021, 9(5): 505.

[2] Moreira J., Alves P., Feliciano A., Aunins J., Carrondo M. Serum-free and serum-containing media for growth of suspended BHK aggregates in stirred vessels. Enzyme and Microbial Technology. 1995, 17: 437–444.

關(guān)于CloudReady^®

CloudReady^®云平臺(tái)生物反應(yīng)器具有高度的自動(dòng)化和穩(wěn)定性，可確保工藝可重復(fù)；支持4×N臺(tái)控制器無(wú)限制拓展，還可兼容Endura SUB^®一次性罐體。

適用于各種貼壁及懸浮哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝的開(kāi)發(fā)與優(yōu)化，支持批次、補(bǔ)料、灌流等多種培養(yǎng)工藝。

圖6 CloudReady^®（500mL，一次性罐體,16聯(lián)）

反應(yīng)器配套D2MS（Data & Device Management System 設(shè)備與數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)），支持設(shè)備和數(shù)據(jù)管理、數(shù)據(jù)分析；用戶和項(xiàng)目管理；DoE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；APC(高級(jí)過(guò)程控制)；UDF(用戶定義函數(shù)）；遠(yuǎn)程監(jiān)看和控制等多種功能。

圖7 D2MS（Data & Device Management System ）設(shè)備與數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)

自研反應(yīng)器放大計(jì)算軟件（圖8）可基于不同放大準(zhǔn)則一鍵計(jì)算工藝參數(shù)，助力生物制品的快速工藝放大。

圖8 迪必爾生物 反應(yīng)器放大計(jì)算軟件

應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心（CARE） 張君軒  供稿