高通量測序后的下游實驗驗證方法之ChIP-seq介紹
此前，我們分享了染色質(zhì)免疫共沉淀測序(ChIP-seq）的數(shù)據(jù)挖掘思路，進而篩選出TF結(jié)合/組蛋白修飾的目標區(qū)域和候選靶基因。
做完ChIP-seq測序后，如果需要對分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進行后期驗證，則需要進行下游實驗設計。ChIP-seq的進一步驗證或后期試驗包括以下5個方面：
1. 簡單驗證
2. 轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾實驗（非靶向），驗證是否影響目標基因表達和細胞功能
3. 靶向目標區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾干擾實驗，檢測其影響下游靶基因的表達
4. 引入突變后，熒光素酶實驗驗證轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的motif，并證明結(jié)合后直接調(diào)控靶基因的表達
5. 超級增強子
一、簡單驗證
（1）目標基區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合/組蛋白修飾的驗證：CHIP-qPCR
（2）檢測目標基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
（3）檢測目標基因蛋白質(zhì)表達水平：Western blot
二、轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾實驗（非靶向），驗證是否影響目標基因表達和細胞功能
（1）轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾：基因的突變/敲降/敲除/過表達、相關蛋白的抑制劑
（2）檢測TF結(jié)合/組蛋白修飾的整體變化：CHIP-seq
（3）檢測目標區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾的變化：CHIP-qPCR
（4）檢測下游靶基因的mRNA水平：RT-qPCR
（5）檢測下游靶基因蛋白質(zhì)水平：Western blot
（6）檢測細胞功能/表型變化
三、靶向目標區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾干擾實驗，檢測其影響下游靶基因的表達
（1）目的基因結(jié)合/修飾干擾細胞系的構建：熒光素酶活性分析實驗（Luciferase activity assay）、CRISPER-CAS9靶向目標區(qū)域引入突變/修飾
（2）檢測目標區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾變化：CHIP-qPCR
（3）檢測熒光素酶報告基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
（4）檢測目標基因蛋白質(zhì)表達水平：Western blot
（5）檢測細胞功能受到的影響：免疫熒光顯微觀察、功能標志物測定……
四、引入突變后，熒光素酶實驗驗證轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的motif，并證明結(jié)合后直接調(diào)控靶基因的表達
top3的motif中，只有MEME-2能夠激活熒光素酶基因表達，表明FUS1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的是MEME-2 motif
在靶基因3’UTR插入熒光素酶基因，只有FUS1組能夠激活熒光素酶基因的表達，表明只有FUS1組具有轉(zhuǎn)錄因子活性
引入S486E突變影響到該轉(zhuǎn)錄因子對MEME-2的結(jié)合，也最終影響到靶基因的表達
五、超級增強子
（1）根據(jù)通用型轉(zhuǎn)錄輔因子Med1在CHIP-seq實驗中富集程度的高低，可以將增強子分為以下兩類:
typical enhancers（TE）：長度為幾百bp
super enhancers（SE）：長度幾千bp
（2）超級增強子的預測建立在增強子的基礎上，可以看做增強子富集的區(qū)域。
（3）相比增強子，超級增強子區(qū)域具有更高的轉(zhuǎn)錄因子的密度，能夠讓轉(zhuǎn)錄效率提高達幾百倍。
（4）H3K27ac是活性增強子的標志，可以通過H3K27ac CHIP-seq鑒定TE和SE。
CHIP-seq實驗成功的關鍵問題
（1）抗體質(zhì)量
ChIP-seq是基于抗體的免疫沉淀實驗，因此它的數(shù)據(jù)質(zhì)量好壞直接取決于抗體的質(zhì)量和特異性。
另外，針對同一蛋白的不同抗體，可能會識別不同的表位（尤其是單克隆抗體）。因此建議針對同一感興趣蛋白測試不同的抗體，通過Western blot檢測knock-down前后的差異幫助選擇。
（2）測序數(shù)據(jù)量
為了捕獲所有真實的結(jié)合位點，而我們看不見摸不著，只能通過測序的reads去計算來幫助判斷，因此測序reads的數(shù)量是一個決定因素。
需要多少reads呢？
這個取決于基因組的大小和感興趣因子的結(jié)合方式（sharp regions for TFs and broad regions for histone marks）。哺乳動物中，鑒定TFs至少要滿足10-20M，broad histone marks至少要10-45M，input對照要和ChIP樣本保持同樣測序深度。reads數(shù)量還取決于抗體質(zhì)量和免疫沉淀的效率。信噪比越高，需要的reads數(shù)可以適當減少。
（3）生物學重復
樣本重復可以看到實驗設計的好壞，選擇相關性高的樣本進行后續(xù)分析
推薦三個生物重復，但兩個現(xiàn)在也能接受（最粗略的實驗設計就是：每個ChIP樣本2個重復，input只有一個沒有重復）
如果樣本間的本質(zhì)差異越大，越需要設置重復，例如從不同人取的樣本。
做完ChIP-seq測序后，如果需要對分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進行后期驗證，則需要進行下游實驗設計。ChIP-seq的進一步驗證或后期試驗包括以下5個方面：
1. 簡單驗證
2. 轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾實驗（非靶向），驗證是否影響目標基因表達和細胞功能
3. 靶向目標區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾干擾實驗，檢測其影響下游靶基因的表達
4. 引入突變后，熒光素酶實驗驗證轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的motif，并證明結(jié)合后直接調(diào)控靶基因的表達
5. 超級增強子
一、簡單驗證
（1）目標基區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合/組蛋白修飾的驗證：CHIP-qPCR
（2）檢測目標基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
（3）檢測目標基因蛋白質(zhì)表達水平：Western blot
二、轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾實驗（非靶向），驗證是否影響目標基因表達和細胞功能
（1）轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾：基因的突變/敲降/敲除/過表達、相關蛋白的抑制劑
（2）檢測TF結(jié)合/組蛋白修飾的整體變化：CHIP-seq
（3）檢測目標區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾的變化：CHIP-qPCR
（4）檢測下游靶基因的mRNA水平：RT-qPCR
（5）檢測下游靶基因蛋白質(zhì)水平：Western blot
（6）檢測細胞功能/表型變化
三、靶向目標區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾干擾實驗，檢測其影響下游靶基因的表達
（1）目的基因結(jié)合/修飾干擾細胞系的構建：熒光素酶活性分析實驗（Luciferase activity assay）、CRISPER-CAS9靶向目標區(qū)域引入突變/修飾
· 確定并驗證與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的motif
· 驗證與該motif結(jié)合之后是否能影響靶基因表達
· 不同區(qū)域引入突變以確定關鍵結(jié)合位點
· 驗證與該motif結(jié)合之后是否能影響靶基因表達
· 不同區(qū)域引入突變以確定關鍵結(jié)合位點
（2）檢測目標區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾變化：CHIP-qPCR
（3）檢測熒光素酶報告基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
（4）檢測目標基因蛋白質(zhì)表達水平：Western blot
（5）檢測細胞功能受到的影響：免疫熒光顯微觀察、功能標志物測定……
用于驗證TF結(jié)合并調(diào)控下游基因的熒光素酶報告系統(tǒng)
四、引入突變后，熒光素酶實驗驗證轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的motif，并證明結(jié)合后直接調(diào)控靶基因的表達
top3的motif中，只有MEME-2能夠激活熒光素酶基因表達，表明FUS1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的是MEME-2 motif在靶基因3’UTR插入熒光素酶基因，只有FUS1組能夠激活熒光素酶基因的表達，表明只有FUS1組具有轉(zhuǎn)錄因子活性
引入S486E突變影響到該轉(zhuǎn)錄因子對MEME-2的結(jié)合，也最終影響到靶基因的表達
五、超級增強子
（1）根據(jù)通用型轉(zhuǎn)錄輔因子Med1在CHIP-seq實驗中富集程度的高低，可以將增強子分為以下兩類:
typical enhancers（TE）：長度為幾百bp
super enhancers（SE）：長度幾千bp
（2）超級增強子的預測建立在增強子的基礎上，可以看做增強子富集的區(qū)域。
（3）相比增強子，超級增強子區(qū)域具有更高的轉(zhuǎn)錄因子的密度，能夠讓轉(zhuǎn)錄效率提高達幾百倍。
（4）H3K27ac是活性增強子的標志，可以通過H3K27ac CHIP-seq鑒定TE和SE。
CHIP-seq實驗成功的關鍵問題
（1）抗體質(zhì)量
ChIP-seq是基于抗體的免疫沉淀實驗，因此它的數(shù)據(jù)質(zhì)量好壞直接取決于抗體的質(zhì)量和特異性。
另外，針對同一蛋白的不同抗體，可能會識別不同的表位（尤其是單克隆抗體）。因此建議針對同一感興趣蛋白測試不同的抗體，通過Western blot檢測knock-down前后的差異幫助選擇。
（2）測序數(shù)據(jù)量
為了捕獲所有真實的結(jié)合位點，而我們看不見摸不著，只能通過測序的reads去計算來幫助判斷，因此測序reads的數(shù)量是一個決定因素。
需要多少reads呢？
這個取決于基因組的大小和感興趣因子的結(jié)合方式（sharp regions for TFs and broad regions for histone marks）。哺乳動物中，鑒定TFs至少要滿足10-20M，broad histone marks至少要10-45M，input對照要和ChIP樣本保持同樣測序深度。reads數(shù)量還取決于抗體質(zhì)量和免疫沉淀的效率。信噪比越高，需要的reads數(shù)可以適當減少。
（3）生物學重復
樣本重復可以看到實驗設計的好壞，選擇相關性高的樣本進行后續(xù)分析
推薦三個生物重復，但兩個現(xiàn)在也能接受（最粗略的實驗設計就是：每個ChIP樣本2個重復，input只有一個沒有重復）
如果樣本間的本質(zhì)差異越大，越需要設置重復，例如從不同人取的樣本。
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ChIP-seq
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