基因編輯是一種對靶基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行敲除、插入和定點突變等精確修飾的基因工程技術，主要通過人工核酸酶實現(xiàn)對基因組的特定基因序列的敲除、插入或精確修飾。目前，主要有三大基因編輯技術，包括：鋅指核酸酶 (Zinc finger nucleases; ZFNs) 技術，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶 (transcription activator-like (TAL) effector nucleases; TALENs) 技術和 CRISPR/Cas9 技術。 ZFNs 是最較早用于基因組編輯的人工合成的限制性內(nèi)切酶，該酶是異源二聚體，包含 DNA 結合鋅指蛋白 (ZFP) 結構域和非特異性 FokI 核酸酶結構域。DNA 切割域的 FokI 核酸酶必須二聚化以切割 DNA。該技術已被用于修飾各種生物體內(nèi)的內(nèi)源性基因。 與 ZFNs 的模塊化結構一樣，TALENs 的羧基末端也含有 FokI 核酸酶結構域，它借助 TALEs (來源于植物致病性黃單胞菌屬細菌) 來識別特異性 DNA 堿基對。相較于 ZFNs 技術，其優(yōu)勢在于可以定點識別靶基因，從而使得基因編輯更加準確高效，其脫靶效應以及細胞毒性也得到了顯著改善。 

圖 1. 不同基因編輯手段的對比

 

2020 年，兩位女性科學家 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna 因發(fā)現(xiàn) CRISPR/Cas9 基因剪刀，而獲得 2020 年諾貝爾化學獎。

 

CRISPR/Cas 系統(tǒng)由一小段 RNA 和一種高效的 DNA 切割酶 (Cas 核酸酶) 組成的系統(tǒng)，該技術不像 TALENs 技術和 ZFNs 技術是依賴于蛋白與靶基因之間的識別，而是由 sgRNA 和靶基因之間形成復合物，從而完成特定基因序列的編輯。

 

CRISPR/Cas9 技術切割效率相對較高且操作簡單，并且可以同時進行多位點的編輯�？傊�，三種不同的基因編輯技術都有其各自的特點。今天小 M 的“重頭戲”，CRISPR/Cas9。 

 

CRISPR/Cas9 的調(diào)控機制 在細菌及古細菌中，CRISPR 系統(tǒng)共分成 3 類，其中 I 類和 Ⅲ 類需要多種 CRISPR 相關蛋白 (Cas 蛋白) 共同發(fā)揮作用。而來自 Streptococcus pyogenes 的 Ⅱ 型系統(tǒng)只需要一種 Cas 蛋白 (Cas9) 即可發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性。因此，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應用最為廣泛。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已經(jīng)成功應用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞。  

 

■ 第一步：捕獲外源 DNA

Cas9 蛋白包含兩個核酸酶結構域：切割非互補 DNA 鏈的 RuvC 結構域和切割互補 DNA 鏈的 HNH 結構域 (如圖 2a)。

噬菌體等外源 DNA 入侵時，CAS 蛋白復合物通常識別 3' 端含 NGG 的前間隔序列鄰近基序 (PAM) 區(qū)域。然后，侵入的噬菌體或質(zhì)粒釋放的短 DNA 片段(稱為 Protospacer)，插入宿主 CRISPR 位點中 (由重復序列隔開)。

 

■ 第二步：crRNA 合成 

CRISPR 序列轉(zhuǎn)錄，形成前體 CRISPR RNA (pre-crRNA)。Cas9 及 RNase III 在 tracrRNA 與 pre-crRNA 上的重復序列配對形成雙鏈 RNA 的條件下，對 pre-crRNA 進行剪切，形成成熟的 tracrRNA-crRNA 雙鏈 RNA (即 sgRNA)。Cas9 核酸酶和 sgRNA 形成 Cas9 核糖核蛋白 (RNP)。

 

■ 第三步：靶向干擾

當外源 DNA 再次進入細胞時，Cas9 蛋白攜帶sgRNA，去識別外源 DNA 的 Protospacer (前間隔序列)，并與之結合，通過 Cas9 解旋酶和核酸酶對靶基因進行剪切。造成靶基因 DNA 的雙鏈斷裂 (DSB)，從而達到干擾靶基因表達的目的，在修復斷裂同時引入基因敲除或敲入。

圖 2. 通過非同源末端連接 (NHEJ) 或同源定向修復 (HDR) 內(nèi)源性修復雙鏈 DNA 斷裂^[2]

 綜上，CRISPR 技術主要是利用位點特異 Cas 核酸酶在基因組靶位點處引入 DNA DSB，再經(jīng)細胞自身的非同源末端連接 (NHEJ) 或同源重組修復 (HDR) 對 DSB 進行修復，最終實現(xiàn)目標基因敲除和堿基編輯等基因組遺傳修飾。  CRISPR/Cas9 的小分子調(diào)控策略 CRISPR 技術在疾病治療、基因功能調(diào)控、藥物研發(fā)等多個方面具有廣闊的應用前景，但也存在脫靶、基因毒性等副作用問題。由于 Cas9 蛋白和 sgRNA 在其自身活性、識別位點及結合能力等方面的不同特性，因此在應用中可以通過對 Cas9 蛋白酶以及與靶 DNA的結合進行有效的調(diào)控。目前，如：遺傳調(diào)節(jié)、小分子激活劑、小分子抑制劑、生物響應性輸送載體以及 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的光/熱/超聲/磁激活等方法已被研究開發(fā)。 

■ 小分子激活劑控制 Cas9 活性的策略

可通過添加小分子來控制 Cas9 的構象變化，來實現(xiàn)對 Cas9 蛋白活性的時空控制。

 

案例 1：當內(nèi)含肽插入 Cas9 蛋白的不同位點，Cas9 核酸酶失活；添加 4-HT (4-hydroxytamoxifen)，通過構象變化和自切割反應去除內(nèi)含肽，可重新激活 Cas9 蛋白（圖 3a）。根據(jù)內(nèi)含肽的插入位點，Cas9 的激活效率 3 倍到 10 倍不等，與野生型 Cas9 相比，這種調(diào)控策略可增加開/脫靶效應比率。

 

圖 3. 小分子激活劑控制 Cas9 活性的策略^[9]

a：通過 4-HT 結合，恢復失活的 Cas9 活性；b：Cas9 和雌激素受體 (ERT2) 的融合被分離在細胞質(zhì)中，通過添加 4-HT 使得融合物進入細胞核，形成 Cas9/sgRNA 復合物  

案例 2：基于化學誘導的 Cas9 蛋白分裂片段的二聚化。Zetsche 等人設計了不同的分裂位點 (Arg535 和 Glu573) 生成分裂 Cas9 (split-Cas9) 蛋白，同時產(chǎn)生 C 端和 N 端Cas9 片段 (可分別與 FK506  結合蛋白 (FKBP) 和 FKBP 雷帕霉素結合結構域 (FRB) 結合)。這種方法通過雷帕霉素誘導的異源二聚作用實現(xiàn)了 split-Cas9 的條件重構和激活。

 

 

■ 小分子抑制劑控制 Cas9 活性的策略

由于 Cas9 活性的升高和持續(xù)可能會導致脫靶效應、染色體易位和遺傳毒性，因此在目標編輯后，Cas9 核酸酶活性必須迅速限制在一個狹窄的時間范圍內(nèi)。

 

如下圖 5 所示，DHFR (ER50)是一個不穩(wěn)定的結構域，可快速靶向 Cas9 蛋白進行蛋白酶體介導的 Cas9 降解，但添加小分子抑制劑甲氧芐氨嘧啶 (TMP) 或 4-OHT 后可以使其穩(wěn)定。用 Cas9-DHFR 或 Cas9-ER50 系統(tǒng)編輯 VEGFA 基因時，用不同劑量的TMP 或 4OHT 劑量依賴性控制靶向 VEGFA 基因的復合物 Cas9-DHFR (ERR50) 的靶向和非靶向活性。 

 

總結
CRISPR-Cas9 系統(tǒng)已成為一種在任何細胞基因組的精確位置進行修改的有效工具。Cas9 介導的 DNA 切割后發(fā)生的主要細胞修復途徑是錯誤的非同源末端連接 (NHEJ) 途徑。同源定向重組 (HDR) 的效率遠遠低于 NHEJ。因此，降低 NHEJ 的頻率，同時增加 Cas9 介導的 DNA 切割后的 HDR 效率，從而提高基因組編輯的整體效率和精準度成為科學家關注的焦點。與此同時，通過研究人員的不斷努力，生物活性小分子提供了一種簡單而有效的調(diào)控策略，可進一步拓寬精確基因組編輯的應用范圍。 

相關產(chǎn)品

RS-1  一種 RAD51 的激活劑，同時可增強 CRISPR/Cas9 的活性。

Nocodazole 可逆的 microtubule 抑制劑。Nocodazole 抑制 Bcr-Abl，增強 CRISPR/Cas9 的活性。

Brefeldin A  一種內(nèi)酯抗生素，是蛋白質(zhì)運輸?shù)奶囟ㄒ种苿�。Brefeldin A 還是一種 CRISPR/Cas9 激動劑，可抑制 HSV-1病毒，并具有抗癌活性。

SCR7 pyrazine 一種 DNA 連接酶 IV (DNA ligase IV) 抑制劑。SCR7 pyrazine 也是一種 CRISPR/Cas9 的增強子，可提高 Cas9 介導的同源性定向修復 (HDR) 的效率。

SCR7 一種不穩(wěn)定的形式，可以自動循環(huán)成穩(wěn)定形式的 SCR7 pyrazine是一種 CRISPR/Cas9 的增強子，可提高 Cas9 介導的同源性定向修復 (HDR) 的效率

Zidovudine 一種核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 (NRTI)，有潛力用于 HIV 感染的研究。Zidovudine 增強 CRISPR/Cas9調(diào)節(jié)的編輯頻率。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務。

 

參考文獻

1. Gibson GJ, Yang M. What rheumatologists need to know about CRISPR/Cas9. Nat Rev Rheumatol. 2017 Apr;13(4):205-216.

2. Westermann L, Neubauer B, Köttgen M. Nobel Prize 2020 in Chemistry honors CRISPR: a tool for rewriting the code of life. Pflugers Arch. 2021 Jan;473(1):1-2.

3. Dominguez AA, Lim WA, Qi LS. Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 Jan;17(1):5-15.

4. Matano M, Date S, Shimokawa M, Takano A, Fujii M, Ohta Y, Watanabe T, Kanai T, Sato T. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nat Med. 2015 Mar;21(3):256-62.

5. Yang H, Wang H, Shivalila CS, Cheng AW, Shi L, Jaenisch R. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 2013 Sep 12;154(6):1370-9.

6. Sánchez-Rivera FJ, Jacks T. Applications of the CRISPR-Cas9 system in cancer biology. Nat Rev Cancer. 2015 Jul;15(7):387-95.

7. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21.

8. Zalatan JG, Lee ME, Almeida R, Gilbert LA, Whitehead EH, La Russa M, Tsai JC, Weissman JS, Dueber JE, Qi LS, Lim WA. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. 2015 Jan 15;160(1-2):339-50.

9. Zhuo C, Zhang J, Lee JH, Jiao J, Cheng D, Liu L, Kim HW, Tao Y, Li M. Spatiotemporal control of CRISPR/Cas9 gene editing. Signal Transduct Target Ther. 2021 Jun 20;6(1):238.

10. Maji B, Gangopadhyay SA, Lee M, Shi M, Wu P, Heler R, Mok B, Lim D, Siriwardena SU, Paul B, Dančík V, Vetere A, Mesleh MF, Marraffini LA, Liu DR, Clemons PA, Wagner BK, Choudhary A. A High-Throughput Platform to Identify Small-Molecule Inhibitors of CRISPR-Cas9. Cell. 2019 May 2;177(4):1067-1079.