肥胖是一個全球性的熱門話題，也推動了對脂肪組織的深入研究。以往的研究發(fā)現(xiàn)，當多余的能量儲存在白色脂肪組織（WAT）時會發(fā)生肥胖，而棕色脂肪組織（BAT）則會促進能量消耗以減少肥胖。在外界或生理刺激下，白色脂肪組織會發(fā)生“褐變”，形成米色脂肪細胞。這些含有豐富線粒體的米色脂肪細胞也能燃燒卡路里，被認為是治療肥胖癥的一種潛在方法。

一些哺乳動物遺傳模型已經(jīng)證明，基因突變可通過控制棕色/米色脂肪細胞產(chǎn)熱而導致肥胖。不過，目前還沒有足夠的證據(jù)，說明控制產(chǎn)熱的人類基因中存在致病性突變。最近的遺傳學證據(jù)表明，Wnt通路的下游突變與脂肪分布有關(guān)，但無法證實Wnt相關(guān)突變與肥胖癥之間有因果關(guān)系。

近日，上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院的王計秋/劉瑞欣/王衛(wèi)慶團隊在《Advanced Science》雜志上發(fā)表論文，首次證實人類RSPO1基因中的一種突變會抑制米色脂肪細胞產(chǎn)熱并導致肥胖。這項成果也許對人類肥胖癥的治療具有重要意義。
 

圖片來源：Advanced Science

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員在篩選出RSPO1突變后，委托賽業(yè)生物構(gòu)建了脂肪組織特異性的hRSPO1轉(zhuǎn)基因小鼠、Rspo1基因敲除小鼠和人源化的Rspo1 p.R219W小鼠，并在這些模型上分析RSPO1突變的影響。研究者采用EchoMRI體成分分析儀測定了活體小鼠的體脂成分，并通過RNA測序分析了各個小鼠模型上的基因表達變化。

技術(shù)路線
01 通過篩選肥胖病例和對照的測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)多名患者攜帶相同的RSPO1突變
02 構(gòu)建hRSPO1轉(zhuǎn)基因小鼠和Rspo1基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)RSPO1過表達導致肥胖，而Rspo1敲除促進脂肪產(chǎn)熱
03 RSPO1通過LGR4-Wnt/β-catenin信號通路抑制米色脂肪細胞的線粒體呼吸和產(chǎn)熱作用
04 攜帶熱點突變的人源化小鼠模型再現(xiàn)了肥胖患者的特征
05 p.R219W突變破壞了RSPO1與細胞外基質(zhì)的結(jié)合，導致更多RSPO1釋放

研究結(jié)果
1.多個肥胖病例攜帶相同的RSPO1突變
為了研究Wnt相關(guān)因子的突變與人類肥胖的關(guān)系，研究人員利用全外顯子組測序?qū)?994個青少年肥胖病例和2161個健康對照的Wnt相關(guān)旁分泌因子進行篩選，發(fā)現(xiàn)12例肥胖患者的RSPO1基因攜帶相同突變（p.R219W/Q）。RSPO1（R-spondin 1）是R-spondin分泌蛋白家族中的一員，可作為Wnt激活劑來增強Wnt信號通路。研究者發(fā)現(xiàn)，p.R219W/Q突變體對Wnt信號通路有相對更高的激活作用。

在分析各種器官和細胞系的基因表達譜后，研究者發(fā)現(xiàn)RSPO1在白色脂肪組織中特異性高表達。通過對兩種小鼠肥胖模型和肥胖受試者的分析，研究者發(fā)現(xiàn)RSPO1主要在內(nèi)臟白色脂肪組織中表達。在進一步分析小鼠單細胞測序數(shù)據(jù)后，研究者發(fā)現(xiàn)Rspo1主要在成纖維細胞中表達，而不是脂肪干細胞。這些結(jié)果表明，RSPO1在內(nèi)臟脂肪中高表達，主要由成纖維細胞產(chǎn)生，其局部水平與肥胖發(fā)展呈正相關(guān)。

2.RSPO1過表達促進了HFD誘導的肥胖
為了研究脂肪組織中RSPO1增加是否會誘導肥胖，研究人員委托賽業(yè)生物構(gòu)建了一種hRSPO1轉(zhuǎn)基因小鼠模型（hRSPO1^Tg）。研究者發(fā)現(xiàn)，在以高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)時，hRSPO1^Tg小鼠的體重增加比野生型小鼠更多，脂肪含量更高，而O₂消耗和CO₂產(chǎn)生更低（圖1），這表明人類RSPO1基因在脂肪組織中的過表達足以減少能量消耗，并促進HFD誘導的肥胖。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中過量的RSPO1表達會抑制線粒體呼吸和棕色/米色脂肪細胞的產(chǎn)熱能力。
 

圖1 人源RSPO1過表達促進飲食誘導的肥胖^[1]

為了進一步分析Rspo1的作用，研究人員又構(gòu)建了Rspo1基因敲除（Rspo1^−/−）小鼠（由賽業(yè)生物提供）。以HFD喂養(yǎng)時，這些小鼠的體重比野生型小鼠更輕，全身脂肪量和白色脂肪組織重量也明顯減少，表明內(nèi)源性Rspo1的敲除增加了能量消耗并抵制了HFD誘導的肥胖。當暴露于長期寒冷時，Rspo1^−/−小鼠的白色脂肪組織表現(xiàn)出強烈的褐變程序，UCP1蛋白水平也顯著增加。由此可以看出，Rspo1的敲除促進了白色脂肪向棕色脂肪的轉(zhuǎn)化。

在后續(xù)的機制分析中，研究者發(fā)現(xiàn)RSPO1對線粒體基因表達和米色脂肪細胞產(chǎn)熱的抑制作用主要依賴于Lgr4受體，而β-catenin也參與了RSPO1/LGR4對米色脂肪細胞的抑制作用（圖2）。Lgr4的敲除以及β-catenin的化學阻斷都減弱了RSPO1的抑制作用。這些數(shù)據(jù)顯示，RSPO1通過LGR4經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路抑制了米色脂肪細胞的線粒體呼吸和產(chǎn)熱能力。
 

圖2 人源RSPO1蛋白以Lgr4/β-catenin依賴性的方式抑制米色脂肪細胞產(chǎn)熱^[1]

3.p.R219W/Q突變體破壞RSPO1與細胞外基質(zhì)的結(jié)合
為了進一步明確RSPO1的p.R219W突變在肥胖中的作用，研究人員利用CRISPR-Cas9方法構(gòu)建了p.R219W點突變基因敲入（Rspo1^R219W）小鼠模型（由賽業(yè)生物提供）。在HFD條件下，這種小鼠的體重增加比野生型小鼠更多，脂肪含量也更高。在急性寒冷刺激下，Rspo1^R219W小鼠的產(chǎn)熱能力下降，白色脂肪細胞的褐變程序也減弱。同時，在Rspo1^R219W小鼠的米色脂肪細胞中，產(chǎn)熱和線粒體呼吸相關(guān)基因的mRNA表達受到抑制，表明RSPO1 p.R219W突變可抑制產(chǎn)熱能力并導致肥胖。

那么，p.R219W/Q突變體是如何發(fā)揮病理作用的呢？研究者發(fā)現(xiàn)，R219殘基位于RSPO1的C端區(qū)域，而這個區(qū)域含有一些堿性氨基酸殘基，形成高密度的正電荷區(qū)域，有利于它們與細胞外基質(zhì)中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）結(jié)合，從而限制RSPO1在細胞外基質(zhì)內(nèi)的擴散。色氨酸（W）和谷氨酰胺（Q）的替代影響了R219位點的正電荷特征，破壞了RSPO1與細胞外基質(zhì)的靜電相互作用，從而導致更多RSPO1蛋白釋放到細胞外空間，過度激活Wnt/β-catenin信號通路（圖3）。
 

圖3 RSPO1 p.R219W/Q突變破壞了其與細胞外基質(zhì)的靜電相互作用并激活Wnt通路^[1]

研究結(jié)論
這項研究驗證了人類RSPO1基因中的一個功能激活突變（p.R219W）可作為遺傳觸發(fā)器，驅(qū)動高脂飲食喂養(yǎng)下的肥胖發(fā)生，它可能通過破壞RSPO1與細胞外基質(zhì)的靜電結(jié)合而抑制產(chǎn)熱能力。阻斷RSPO1信號可以促進線粒體呼吸和產(chǎn)熱，減少脂肪堆積，這突出了其在治療人類肥胖癥中的意義。

原文檢索：
[1] Sun Y, Zhang J, Hong J, et al. Human RSPO1 Mutation Represses Beige Adipocyte Thermogenesis and Contributes to Diet-Induced Adiposity. Adv Sci (Weinh). 2023 Feb 8:e2207152. https://doi.org/10.1002/advs.202207152
 

Rspo1 Flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Rspo1^em1Cflox/Cya
品系編號：
CKOCMP-192199-Rspo1-B6J-VA
產(chǎn)品編號：
S-CKO-04549
應(yīng)用方向：
脂肪組織,生殖系統(tǒng),腎和泌尿系統(tǒng),內(nèi)/外分泌腺
打靶方案：