前文我們已經(jīng)介紹過,PROTAC 分子的設(shè)計之初,靶蛋白配體、E3 連接酶配體和兩者中間的連接子三者應(yīng)該分別考量。
在 PROTAC 介導(dǎo)的蛋白降解途徑中,其中靶標(biāo)配體 (POI)-PROTAC-E3 連接酶等三元復(fù)合物的有效形成同樣起到重要作用。三元復(fù)合物的任一單元的濃度改變帶來的不僅僅是線性變化,“鐘” 形模型常常被用來解釋這樣的活性與濃度相關(guān)性,文獻(xiàn)中提及的 hook effect 也正是形容這種情形。
另外,在活性研究中,協(xié)同效應(yīng) (cooperativity, α) 這一詞匯,被用于解釋 PROTAC 受 POI 與 E3 連接酶配體間蛋白蛋白相互作用 (PPI) 的影響。當(dāng) α 大于 1 時,POI 和 E3 是正協(xié)同效應(yīng),對三元復(fù)合物的形成有利。
圖 1. PROTAC 降解能力的“鐘”形模型與協(xié)同效應(yīng)示意圖[1]
1. 依賴溶酶體途徑的降解類分子
PROTAC 主要依賴泛素-蛋白酶體途徑,其對應(yīng)降解的大多為胞質(zhì)蛋白與核蛋白。Bertozzi 教授的研究團(tuán)隊報道了一項靶向胞外蛋白的降解技術(shù)——溶酶體靶向嵌合體 (LYTAC)。已證明 LYTAC 成功降解了表皮生長因子受體 (EGFR)、程序性死亡配體 1 (PD-L1) 等膜上蛋白。今年 6 月,Morreale 團(tuán)隊等人在 Cell 發(fā)表的 BacPROTACs mediate targeted protein degradation in bacteria 一文報道了一種用于革蘭氏陽性菌和分枝桿菌靶向蛋白降解的創(chuàng)新技術(shù),BacPROTAC。
他們基于 Clausen 實驗室之前的一項發(fā)現(xiàn):在枯草芽孢桿菌和其他革蘭氏陽性菌中,AAA 去折疊酶 ClpC 和蛋白酶 ClpP 組成的 ClpC–ClpP (ClpCP) 蛋白酶是降解細(xì)菌中未折疊和聚集蛋白質(zhì)的重要蛋白水解酶。由于磷酸精氨酸的對接位點(diǎn)位于 ClpC ATP 酶的氨基末端結(jié)構(gòu)域,磷酸精氨酸 (pArg) 可作為 ClpCP 蛋白酶復(fù)合體的降解標(biāo)簽。
Morreale 等人報道的細(xì)菌 PROTACs (BacPROTACs) 由 POI 配體、Linker 和 ClpCNTDs 配體組成,可誘導(dǎo)細(xì)菌這種沒有泛素蛋白酶體的非真核生物蛋白的體內(nèi)外降解。如圖 3A,研究團(tuán)隊在體外首先以單體鏈霉親和素 (mSA) 作為模型蛋白,通過 BacPROTAC 將 pArg (ClpCNTD 配體) 與生物素 (mSA 的配體) 結(jié)合,形成 BacPROTAC-1 三元復(fù)合物,有效降解靶蛋白。BacPROTAC-1 與 mSA 和 ClpCNTD 結(jié)合的 KD 為 3.9 和 2.8 μM (如圖 3C)。
圖 3. BacPROTAC-1 對枯草芽孢桿菌 ClpCP 的體外重編程[6]
由于磷精氨酸的化學(xué)穩(wěn)定性等方面存在問題,在體內(nèi)的應(yīng)用有限。作者團(tuán)隊將內(nèi)源性的磷酸化精氨酸殘基 (pArg) 換成了高選擇性的 sCym-1。sCym-1 不但可以和枯草芽孢桿菌的 ClpCP 結(jié)合,還可以與分歧桿菌的 ClpC1P1P2 結(jié)合。
圖 5. BacPROTACs 可以對分枝桿菌 ClpC1P1P2 進(jìn)行重編程[6]
上:BRDTBD1-directed BacPROTACs: 通過不同的 Linker 和連接位點(diǎn)連接 JQ1 到dCymM。下:分枝桿菌 ClpC1P1P2 與 BD1 孵育后降解的 SDS-PAGE 分析。
總之,如圖 6 所示:PROTACs 通過招募 E3 連接酶來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解,E3 連接酶使得靶蛋白貼上泛素化標(biāo)簽,最后蛋白酶體降解泛素化的蛋白質(zhì)。
BacPROTACs 以高度特異的方式將細(xì)菌 ClpCP 蛋白酶定向到底物上,它不但可以誘導(dǎo)底物和蛋白酶之間的接近,并且通過結(jié)合誘導(dǎo)無活性的 ClpCP 十聚體重組為有活性的六聚體形式,直接啟動 ClpCP 水解靶標(biāo)蛋白。
圖 6. 蛋白質(zhì)降解的異雙功能方法[5]
在降解劑分類里,分子膠 (Molecular glues) 指同樣發(fā)揮誘導(dǎo)蛋白降解作用卻無 Linker 連接的一類分子,如Thalidomide、CC-92480、CC-90009 等結(jié)構(gòu)。分子膠在結(jié)構(gòu)上更接近傳統(tǒng)小分子,在膜透過性和生物利用度上更具優(yōu)勢,是 PROTAC 型降解劑的一個改造方向。
降解劑的最終目的是降解相關(guān)的蛋白, 無論是依賴泛素酶途徑的 PROTAC,依賴蛋白酶體途徑的 LYTAC,依賴 (ClpCP) 蛋白酶的 BacPROTAC。除 Kd 值測定之外,Western Blot 實驗在驗證蛋白降解方面更為直觀,因此常常被用于 PROTAC 類分子活性的測試。
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