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簡化甲基化測序RRBS在醫(yī)學(xué)、物種保護(hù)、農(nóng)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域的優(yōu)勢及研究成果
本期我們通過3篇高分文章來解讀簡化甲基化測序（RRBS）技術(shù)優(yōu)勢及研究成果（醫(yī)學(xué)+物種保護(hù)+農(nóng)學(xué)）。
DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，是目前及未來很長一段時間的研究熱點(diǎn)之一。DNA甲基化測序方法較多，研究者可以根據(jù)實(shí)驗?zāi)康倪x擇最佳的研究方案。如在研究調(diào)控區(qū)域甲基化狀態(tài)的應(yīng)用場景中，RRBS就是最具性價比的方法之一。
關(guān)于RRBS
簡化甲基化測序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行酶切，富集啟動子及CpG島等重要的表觀調(diào)控區(qū)域并進(jìn)行重亞硫酸鹽測序。該技術(shù)顯著提高了高CpG區(qū)域的測序深度，在CpG島、啟動子區(qū)域和增強(qiáng)子元件區(qū)域可以獲得高精度的分辨率，是一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。
為了適應(yīng)科研技術(shù)的需要，易基因進(jìn)一步開發(fā)了可在更大區(qū)域內(nèi)捕獲CpG位點(diǎn)的雙酶切RRBS(dRRBS)，可研究更廣泛區(qū)域的甲基化，包括CGI shore等區(qū)域。
為助力低樣本量多維度分析，易基因開發(fā)了富集覆蓋CpG島、啟動子、增強(qiáng)子、CTCF結(jié)合位點(diǎn)的甲基化靶向測序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和樣本復(fù)用，使其具有高度可擴(kuò)展性，并適用于有限的樣本和單個細(xì)胞。
技術(shù)優(yōu)勢
精確度高：在其覆蓋范圍內(nèi)可達(dá)到單堿基分辨率。
重復(fù)性好：多樣本的覆蓋區(qū)域重復(fù)性可達(dá)到85%-95%，適用多樣本間的差異分析。
性價比高：測序區(qū)域針對高CpG區(qū)域，數(shù)據(jù)利用率更高。
案例分析1：腸道功能鑒定（團(tuán)隊文章）
RRBS揭示腸道對早產(chǎn)的快速適應(yīng)涉及喂養(yǎng)相關(guān)的豬腸道基因DNA甲基化重編程
Gao F,et al. Rapid Gut Adaptation to Preterm Birth Involves Feeding-Related DNA Methylation Reprogramming of Intestinal Genes in Pigs. Front Immunol. 2020;11:565.
研究摘要：
早產(chǎn)后，未成熟的腸道功能和免疫功能必須迅速適應(yīng)細(xì)菌定植和腸內(nèi)喂養(yǎng)。作者為驗證腸道表觀遺傳變化與早產(chǎn)及首次喂養(yǎng)時的腸道反應(yīng)有關(guān)，以仔豬為模型，對早產(chǎn)豬和足月豬進(jìn)行全腸外營養(yǎng)（TPN）或部分腸內(nèi)喂養(yǎng)5天，然后用牛奶進(jìn)行純腸內(nèi)喂養(yǎng)，直到第26天（斷奶年齡）。比較分析早產(chǎn)豬和足月豬在第0天、第5天和第26天的腸道結(jié)構(gòu)、功能、微生物組、DNA甲基組和基因表達(dá)（每組n=8）。RRBS結(jié)果顯示，出生時早產(chǎn)豬腸道出現(xiàn)絨毛萎縮和整體高甲基化，影響與Wnt信號通路相關(guān)的基因。在生命的前5天，高甲基化相關(guān)的LBP（lipopolysaccharide binding protein）和TLR4（Toll-like receptor 4）通路基因表達(dá)明顯降低，但大多數(shù)早期甲基化差異在第26天消失。直到第26天，早產(chǎn)豬的蔗糖酶和麥芽糖酶活性仍然降低，腸道微生物群發(fā)生改變。0-5天期間顯示許多新的甲基化差異，主要表現(xiàn)在未提供腸內(nèi)喂養(yǎng)（TPN喂養(yǎng)）的情況下。這些甲基化差異影響了與細(xì)胞代謝相關(guān)的腸道基因，包括通過啟動子低甲基化增加GCK（葡萄糖激酶）表達(dá)�？傊�，未成熟腸道在早產(chǎn)后可迅速適應(yīng)其基因甲基化和表達(dá)的能力，只有少數(shù)早產(chǎn)相關(guān)缺陷會持續(xù)到斷奶。結(jié)果表明早期腸內(nèi)喂養(yǎng)對于刺激腸道基因的甲基化重編程可能很重要，從而使腸道快速適應(yīng)早產(chǎn)環(huán)境。
案例分析2：物種保護(hù)（團(tuán)隊文章）
RRBS+RNA-seq揭示遷地保護(hù)金絲猴（Rhinopithecus roxellana）的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄特征
Du Zhang,et al. Epigenetic and transcriptional signatures of ex situ conserved golden snub-nosed monkeys (Rhinopithecus roxellana). Biological Conservation 237 (2019) 175–184
研究摘要：采集野生和圈養(yǎng)金絲猴的血液樣本，研究人員使用簡化甲基化RRBS和轉(zhuǎn)錄組RNA-seq進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)圈養(yǎng)組金絲猴的DNA甲基化和基因表達(dá)與野生組相比均存在顯著差異，這和人類圈養(yǎng)組金絲猴的特定食物供應(yīng)和圈養(yǎng)環(huán)境與管理措施有關(guān)。KEGG通路分析顯示，差異表達(dá)基因在廣泛的生理功能通路中富集，且大部分與免疫和代謝功能相關(guān)，特別是自噬相關(guān)通路中的一組核心基因如ATP6V0A1和PPM1D均存在相關(guān)聯(lián)的差異DNA甲基化和基因表達(dá)。研究結(jié)果表明，遷地保護(hù)金絲猴對人類干預(yù)保護(hù)表現(xiàn)出明顯的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄適應(yīng)，這一結(jié)果為未來生物標(biāo)志物的開發(fā)提供基礎(chǔ)，表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄特征或可用于瀕危動物物種遷地保護(hù)計劃中的風(fēng)險評估。
案例分析3：動物育種
RRBS揭示不同孵化溫度和CO2濃度中的雞心臟組織全基因組DNA甲基化
Corbett RJ, et al. Genome-Wide Assessment of DNA Methylation in Chicken Cardiac Tissue Exposed to Different Incubation Temperatures and CO2 Levels. Front Genet. 2020;11:558189.
研究摘要：
孵化過程中的溫度和CO2濃度對肉雞的發(fā)育有著深遠(yuǎn)的影響。此前許多研究發(fā)現(xiàn)這些參數(shù)的差異對孵化心重 (heart weight，HW) 有顯著影響。早期生活環(huán)境也被證明會影響肉雞后期的生產(chǎn)性能，因此表觀遺傳機(jī)制可能介導(dǎo)環(huán)境刺激引起的長期生理變化。作者利用RRBS技術(shù)評估84只在兩種不同蛋殼溫度（EST；37.8℃和38.9℃）和三種CO2濃度（0.1%、0.4%和0.8%）下孵化的肉雞幼體心臟組織的DNA甲基化模式，并進(jìn)行差異甲基化分析。
研究結(jié)果驗證了ABLIM2、PITX2和THRSP三個基因的甲基化和表達(dá)的協(xié)調(diào)變化，確定孵化后小雞心臟的差異甲基化模式與孵化EST和CO2的差異有關(guān)，并且這種差異可能通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和基因表達(dá)的變化影響心臟的生長和發(fā)育。此外，本研究還鑒定了負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)體溫的其他器官（包括下丘腦和甲狀腺）的表觀遺傳模式可能有助于表征調(diào)節(jié)心臟發(fā)育的溫度驅(qū)動差異機(jī)制�？傊�，對早期生活環(huán)境影響的表觀遺傳特征了解可以作為未來動物表現(xiàn)預(yù)測因子，從而有利于動物育種。
RRBS繪制DNA甲基化圖譜概述
參考文獻(xiàn)：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.00565/full
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2020.558189/full
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0006320719302149?via%3Dihub
DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，是目前及未來很長一段時間的研究熱點(diǎn)之一。DNA甲基化測序方法較多，研究者可以根據(jù)實(shí)驗?zāi)康倪x擇最佳的研究方案。如在研究調(diào)控區(qū)域甲基化狀態(tài)的應(yīng)用場景中，RRBS就是最具性價比的方法之一。
關(guān)于RRBS
簡化甲基化測序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行酶切，富集啟動子及CpG島等重要的表觀調(diào)控區(qū)域并進(jìn)行重亞硫酸鹽測序。該技術(shù)顯著提高了高CpG區(qū)域的測序深度，在CpG島、啟動子區(qū)域和增強(qiáng)子元件區(qū)域可以獲得高精度的分辨率，是一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。
為了適應(yīng)科研技術(shù)的需要，易基因進(jìn)一步開發(fā)了可在更大區(qū)域內(nèi)捕獲CpG位點(diǎn)的雙酶切RRBS(dRRBS)，可研究更廣泛區(qū)域的甲基化，包括CGI shore等區(qū)域。
為助力低樣本量多維度分析，易基因開發(fā)了富集覆蓋CpG島、啟動子、增強(qiáng)子、CTCF結(jié)合位點(diǎn)的甲基化靶向測序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和樣本復(fù)用，使其具有高度可擴(kuò)展性，并適用于有限的樣本和單個細(xì)胞。
技術(shù)優(yōu)勢
精確度高：在其覆蓋范圍內(nèi)可達(dá)到單堿基分辨率。
重復(fù)性好：多樣本的覆蓋區(qū)域重復(fù)性可達(dá)到85%-95%，適用多樣本間的差異分析。
性價比高：測序區(qū)域針對高CpG區(qū)域，數(shù)據(jù)利用率更高。
案例分析1：腸道功能鑒定（團(tuán)隊文章）
RRBS揭示腸道對早產(chǎn)的快速適應(yīng)涉及喂養(yǎng)相關(guān)的豬腸道基因DNA甲基化重編程
Gao F,et al. Rapid Gut Adaptation to Preterm Birth Involves Feeding-Related DNA Methylation Reprogramming of Intestinal Genes in Pigs. Front Immunol. 2020;11:565.
研究摘要：
早產(chǎn)后，未成熟的腸道功能和免疫功能必須迅速適應(yīng)細(xì)菌定植和腸內(nèi)喂養(yǎng)。作者為驗證腸道表觀遺傳變化與早產(chǎn)及首次喂養(yǎng)時的腸道反應(yīng)有關(guān)，以仔豬為模型，對早產(chǎn)豬和足月豬進(jìn)行全腸外營養(yǎng)（TPN）或部分腸內(nèi)喂養(yǎng)5天，然后用牛奶進(jìn)行純腸內(nèi)喂養(yǎng)，直到第26天（斷奶年齡）。比較分析早產(chǎn)豬和足月豬在第0天、第5天和第26天的腸道結(jié)構(gòu)、功能、微生物組、DNA甲基組和基因表達(dá)（每組n=8）。RRBS結(jié)果顯示，出生時早產(chǎn)豬腸道出現(xiàn)絨毛萎縮和整體高甲基化，影響與Wnt信號通路相關(guān)的基因。在生命的前5天，高甲基化相關(guān)的LBP（lipopolysaccharide binding protein）和TLR4（Toll-like receptor 4）通路基因表達(dá)明顯降低，但大多數(shù)早期甲基化差異在第26天消失。直到第26天，早產(chǎn)豬的蔗糖酶和麥芽糖酶活性仍然降低，腸道微生物群發(fā)生改變。0-5天期間顯示許多新的甲基化差異，主要表現(xiàn)在未提供腸內(nèi)喂養(yǎng)（TPN喂養(yǎng)）的情況下。這些甲基化差異影響了與細(xì)胞代謝相關(guān)的腸道基因，包括通過啟動子低甲基化增加GCK（葡萄糖激酶）表達(dá)�？傊�，未成熟腸道在早產(chǎn)后可迅速適應(yīng)其基因甲基化和表達(dá)的能力，只有少數(shù)早產(chǎn)相關(guān)缺陷會持續(xù)到斷奶。結(jié)果表明早期腸內(nèi)喂養(yǎng)對于刺激腸道基因的甲基化重編程可能很重要，從而使腸道快速適應(yīng)早產(chǎn)環(huán)境。
早產(chǎn)豬和足月豬腸道的甲基化差異
案例分析2：物種保護(hù)（團(tuán)隊文章）
RRBS+RNA-seq揭示遷地保護(hù)金絲猴（Rhinopithecus roxellana）的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄特征
Du Zhang,et al. Epigenetic and transcriptional signatures of ex situ conserved golden snub-nosed monkeys (Rhinopithecus roxellana). Biological Conservation 237 (2019) 175–184
研究摘要：采集野生和圈養(yǎng)金絲猴的血液樣本，研究人員使用簡化甲基化RRBS和轉(zhuǎn)錄組RNA-seq進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)圈養(yǎng)組金絲猴的DNA甲基化和基因表達(dá)與野生組相比均存在顯著差異，這和人類圈養(yǎng)組金絲猴的特定食物供應(yīng)和圈養(yǎng)環(huán)境與管理措施有關(guān)。KEGG通路分析顯示，差異表達(dá)基因在廣泛的生理功能通路中富集，且大部分與免疫和代謝功能相關(guān)，特別是自噬相關(guān)通路中的一組核心基因如ATP6V0A1和PPM1D均存在相關(guān)聯(lián)的差異DNA甲基化和基因表達(dá)。研究結(jié)果表明，遷地保護(hù)金絲猴對人類干預(yù)保護(hù)表現(xiàn)出明顯的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄適應(yīng)，這一結(jié)果為未來生物標(biāo)志物的開發(fā)提供基礎(chǔ)，表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄特征或可用于瀕危動物物種遷地保護(hù)計劃中的風(fēng)險評估。
DMR和DEG匯總
案例分析3：動物育種
RRBS揭示不同孵化溫度和CO2濃度中的雞心臟組織全基因組DNA甲基化
Corbett RJ, et al. Genome-Wide Assessment of DNA Methylation in Chicken Cardiac Tissue Exposed to Different Incubation Temperatures and CO2 Levels. Front Genet. 2020;11:558189.
研究摘要：
孵化過程中的溫度和CO2濃度對肉雞的發(fā)育有著深遠(yuǎn)的影響。此前許多研究發(fā)現(xiàn)這些參數(shù)的差異對孵化心重 (heart weight，HW) 有顯著影響。早期生活環(huán)境也被證明會影響肉雞后期的生產(chǎn)性能，因此表觀遺傳機(jī)制可能介導(dǎo)環(huán)境刺激引起的長期生理變化。作者利用RRBS技術(shù)評估84只在兩種不同蛋殼溫度（EST；37.8℃和38.9℃）和三種CO2濃度（0.1%、0.4%和0.8%）下孵化的肉雞幼體心臟組織的DNA甲基化模式，并進(jìn)行差異甲基化分析。
研究結(jié)果驗證了ABLIM2、PITX2和THRSP三個基因的甲基化和表達(dá)的協(xié)調(diào)變化，確定孵化后小雞心臟的差異甲基化模式與孵化EST和CO2的差異有關(guān)，并且這種差異可能通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和基因表達(dá)的變化影響心臟的生長和發(fā)育。此外，本研究還鑒定了負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)體溫的其他器官（包括下丘腦和甲狀腺）的表觀遺傳模式可能有助于表征調(diào)節(jié)心臟發(fā)育的溫度驅(qū)動差異機(jī)制�？傊�，對早期生活環(huán)境影響的表觀遺傳特征了解可以作為未來動物表現(xiàn)預(yù)測因子，從而有利于動物育種。
RRBS繪制DNA甲基化圖譜概述參考文獻(xiàn)：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.00565/full
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2020.558189/full
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0006320719302149?via%3Dihub
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