本期我們通過3篇高分文章來解讀微量樣本甲基化測序在腫瘤中的應用。
 
01 肝細胞癌診斷和預后
大家好，這里是專注表觀組學十余年，領跑多組學科研服務的易基因。本期我們通過3篇高分文章來解讀微量樣本甲基化測序在腫瘤中的應用。
 

標題：Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma（循環(huán)腫瘤DNA甲基化標志物在肝細胞癌診斷和預后中的價值）
期刊：Nature materials
2021影響因子: 43.841
發(fā)表時間：2017.11

摘要：
目前還沒有一種有效的基于血液的方法來診斷和判斷肝細胞癌(HCC)的預后。攜帶癌癥特異性遺傳和表觀遺傳突變的循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)可以實現非侵入性的“液體活檢”，用于癌癥的診斷和監(jiān)測。在這里，作者通過比較肝癌組織和正常白細胞，確定了一組肝癌特異性甲基化標志物，并顯示肝癌腫瘤DNA和匹配的血漿ctDNA的甲基化特征高度相關。利用來自1,098例肝癌患者和835例正常對照的cfDNA樣本，作者構建了一個在診斷方面具有特異性和高度敏感性(P<0.001)的診斷預測模型，該模型與腫瘤負荷、治療反應和分期高度相關。此外，作者還建立了預后預測模型，有效地預測了患者的預后和生存期(P<0.001)。這些發(fā)現共同證明了ctDNA甲基化標記物在肝癌的診斷、監(jiān)測和預后中的作用。

隊列：
為了研究肝細胞癌的ctDNA，作者采集了中國肝細胞癌患者和隨機選擇的健康對照者的血漿樣本，得到了715名肝癌患者和560名正常健康對照的訓練隊列，以及383名肝癌患者和275名健康對照的驗證隊列。

結果：
ctDNA在血液中的含量極微，每毫升血中僅有約20ng，并且混雜在更大量的正常游離DNA中，在這么微量的ctDNA中檢測單個堿基的甲基化水平具有很大的挑戰(zhàn)。

作者首先從全基因組水平上對肝癌組織和正常血液DNA的485，000個CpG位點甲基化水平進行了比較，篩選出差異性最顯著的位點；設計相應的鎖式探針(Padlock probe)，對近兩千例肝癌和正常人血漿中提取的微量ctDNA進行了甲基化PCR擴增和測序（探針捕獲靶向甲基化測序）；確定了這些位點的甲基化水平后，進而通過大量的統(tǒng)計學分析和計算，并利用多種人工智能模擬的機器學習方法，最后分別篩選出10個和8個位點建立了診斷模型和生存預后模型（圖1)。
 

圖1.數據生成和分析流程圖

該診斷模型在訓練隊列715例肝癌患者和560例正常人中的診斷敏感性和特異性分別達到了85.7%和94.3%（圖2a），在驗證隊列383例肝癌患者和275例正常人中的診斷敏感性和特異性分別達到了83.3%和90.5%（圖2b）。作者還證明了這個模型可以將肝癌與正常對照區(qū)分開來(圖2c、d)，此外，這10個標記物的無監(jiān)督分級聚類能夠以高度的特異性和敏感度將HCC與正常對照區(qū)分開來(圖2e，f)。
   
此外，該模型還能準確的反映肝癌患者的TNM分期、體內有無腫瘤殘留、對治療的反應以及有無復發(fā)等（圖3）。
   
而對1049例生存資料完整的肝癌患者，依據生存預后模型進行評分，低風險組患者的預后顯著優(yōu)于高風險組患者（圖4），顯示出利用該模型可以準確預測肝癌患者的預后，有利于對不同的風險的患者進行更為個體化的治療。
   
02 腫瘤溯源

標題：Identification of methylation haplotype blocks aids in deconvolution of heterogeneous tissue samples and tumor tissue-of-origin mapping from plasma DNA.（甲基化單倍型鑒定有助于異質組織樣本的去卷積以及根據血漿DNA的對腫瘤溯源）

期刊：Nature genetics

2021影響因子: 38.33

發(fā)表時間：2017.4

摘要：
哺乳動物基因組中相鄰的CpG位點可以由于甲基轉移酶或去甲基酶的加工性而共享相似的甲基化狀態(tài)，而DNA甲基化是細胞類型特異性的，并且該模式可以用于分析異源樣品的相對細胞組成，因此共甲基化的CpG可以作為一組基因組特征用于標記組織的來源。作者對人體全基因組中表現出高度一致得甲基化區(qū)域進行系統(tǒng)性調查，使用61組全基因組亞硫酸氫鹽測序(WGBS)數據定義了147,888個緊密耦合的CpG位點，稱為甲基化單倍型(MHBs)，并用101組簡化代表性亞硫酸氫鹽測序(RRBS)數據和637組甲基化芯片數據進一步驗證了這一點。還使用一種稱為甲基化單倍型負荷(MHL)的指標，作者在區(qū)塊（blocks）水平上進行了組織特異性甲基化分析。最后，作者使用甲基化單倍型對59例癌癥患者的無細胞循環(huán)DNA中的腫瘤負荷和組織起源進行了定量估計。

方法：
作者首先通過61 組WGBS數據發(fā)現了MHB(甲基化單倍型區(qū)塊)，接著利用101 組RRBS數據和637組甲基化芯片數據對MHB進行驗證。建立甲基化單倍型負荷（MHL）模型，進行組織特異性MHB分析，最后使用29個WGBS數據和14個RRBS數據以及59個RRBS數據（癌癥患者血清）；10個RRBS數據（和血清配對的腫瘤組織）；75個RRBS數據（對照血清）對模型進行訓練和測試（圖1）。
 

結果：
由61組WGBS數據建立的MHBs代表了一種獨特的基因組特征，它與多個已知的基因組元件部分重疊(圖2)。在所有MHBs中，60828個(41.1%)位于基因間隔區(qū)，87060個(58.9%)位于轉錄區(qū)。這些MHBs在增強子、超級增強子、啟動子、CpG島和印記基因上顯著富集(P<1.0×10−6)。
   
 
為了能夠對許多樣本中單個MHBs中的甲基化模式進行定量分析，作者需要一個單一的度量來定義每個區(qū)塊中多個CpG位點的甲基化模式。理想情況下，這一指標不僅是區(qū)塊中所有CpG位點的平均甲基化水平的函數，而且還可以捕捉單個DNA分子上的共甲基化模式。因此，作者定義了甲基化單倍型負荷(MHL)，對比其他定量方法，NHL表現出更好的MHB區(qū)分能力（圖3）。
   
作者發(fā)現組織特異性MHL在癌癥患者血漿中存在，但在正常血漿或全血中無法檢測到，因此組織特異性MHL在相應的組織和癌癥血漿中可見，這表明組織起源標測的可行性（圖4a）。接著，作者在基于10個人類正常組織的WGBS和RRBS數據集中，篩選出具有組織特異性的MHB（圖4b），將預測模型應用于來自癌癥患者和正常個體的血漿樣品,預測準確性平均達到82.8%, 88.5%, 91.2%（分別是CCP,LCP和NCP樣本）（圖4c）。  
這項研究表明，血漿中的ctDNA甲基化單倍型分型可能是是一種用于早期檢測腫瘤及其主要生長部位，以及連續(xù)監(jiān)測腫瘤進展和多器官轉移的有效指標。
 

03 泛癌種診斷和預后

標題：DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of common cancers（DNA甲基化標志物在常見癌癥診斷和預后中的應用）

期刊：Proc Natl Acad Sci U S A.

2021影響因子: 11.205

發(fā)表時間：2017.5

摘要：
使用微創(chuàng)活檢識別特定癌癥對于改善癌癥的診斷、治療選擇和預后預測有著很大的幫助。利用來自癌癥基因組圖譜(TCGA)的全基因組甲基化數據和機器學習方法，作者評估了DNA甲基化在區(qū)分四種常見癌癥(乳腺癌、結腸癌、肝癌和肺癌)腫瘤組織和正常組織中的有效性。作者在1,619個腫瘤樣本和173個鄰近正常組織樣本的訓練隊列中確定了癌癥標記物。作者的發(fā)現在一個單獨的TCGA隊列中得到了驗證，DNA甲基化分析可以預測癌癥和正常組織，準確率超過95%，同時也準確地將30個轉移到肝臟的結直腸癌中的29個和34個轉移到肺的結直腸癌中的32個確定下來。作者發(fā)現這種檢測方法還可以預測患者的預后和存活率。綜上所述，這些發(fā)現證明了甲基化生物標記物對描述癌癥分子特征的作用，并對診斷和預后有一定的意義。

結果：
與不同癌癥類型的甲基化情況相關的無監(jiān)督等級聚類和熱圖顯示，甲基化圖譜能夠識別癌癥特異性甲基化特征。ROC曲線表明，對不同腫瘤類型的預測具有較高的敏感性和特異性，因此甲基化特征可以區(qū)分不同的癌癥類型和相應的正常組織（圖1）。
 

 
由于識別起源組織對于腫瘤轉移患者選擇最佳的治療策略是至關重要的，因此除了原發(fā)腫瘤外，作者還分析了30例結直腸癌肝轉移和34例結直腸癌肺轉移病例。研究發(fā)現，無監(jiān)督分級聚類可以將這些轉移與結腸癌或正常組織區(qū)分開來(圖2)。
   
接下來，作者評估了甲基化標記對每種癌癥的預后效果。該模型在Kaplan-Meier分析中區(qū)分低風險組和高風險組以及具有顯著P值的相關對數等級檢驗中表現良好，表明甲基化標簽在一定程度上可以預測BRCA和LUAD的預后。

鑒于DNA甲基化是基因表達的重要表觀遺傳調節(jié)因子，作者研究了癌癥和正常組織中基因位點的差異甲基化是如何與基因表達相關的。作者觀察到啟動子甲基化和基因表達之間的負相關，并確定了幾個已知在癌癥發(fā)生中起重要作用的基因，以及在LIHC中功能相對未知的基因。在表達降低的高甲基化基因中，作者選擇了一個LIHC的相關基因FUZ，FUZ的過表達抑制了LIHC細胞系的生長(圖3)，這說明癌癥甲基化特征與其基因表達模式和功能相關。  
作者認為，DNA甲基化可以通過更準確的診斷來幫助患者改善預后，特別是相對惰性或者侵襲性腫瘤。雖然在本文中只選取了4種常見癌癥，但是作者認為，DNA甲基化檢測可以應用于更多不同種類的癌癥診療中，其最大的優(yōu)勢在于只需要少量的組織獲得足夠的DNA就可以完成檢測。
 
參考文獻：
https://www.nature.com/articles/nmat4997
https://www.nature.com/articles/ng.3805
https://www.pnas.org/content/114/28/7414