Olink應用:基于潑尼松聯(lián)合mTOR抑制劑西羅莫司治療腹膜后纖維化研究
影響因子：27.973
技術：Olink target 96-plex inflammatory panel（由上海伯豪生物提供技術服務），流式細胞術，電子計算機斷層掃描（CT），免疫組化技術
腹膜后纖維化（RPF）是一種罕見的自身免疫性疾病，在腹膜后有纖維組織生長并伴隨炎癥反應發(fā)生。目前常見的治療方法是長期服用糖皮質(zhì)激素（如潑尼松）來控制炎癥，然而，副作用很常見，但減少劑量后又會導致疾病頻繁復發(fā)。因此，尋找更安全、副作用更小的藥物便極為重要。
本研究作者通過基因-疾病-藥物數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 是 RPF 中的關鍵信號蛋白，而mTOR 抑制劑西羅莫司影響許多RPF 通路，由此設計了一種臨床療法，將逐漸減少劑量的潑尼松與長期穩(wěn)定劑量的mTOR 抑制劑西羅莫司相結合。而后作者實施了一項單臂臨床試驗，評估了 8名 RPF 患者在第 0、12 和 48 周時的治療效果。通過CT監(jiān)測纖維組織大小，生化實驗室檢測炎癥和腎功能的標志物以用于評估藥物副作用，流式細胞儀檢測免疫細胞類型和豐度， Olink蛋白質(zhì)組學檢測血漿炎癥蛋白的豐度。
結果顯示，聯(lián)合治療后，患者纖維化組織縮小一半左右，急性炎癥標志物減少70%，大部分腎功能異�；颊呋謴驼�。在分子方面，包括TH2，TH17和cTFH細胞在內(nèi)的纖維化相關T細胞亞群減少，腫瘤壞死因子和相關細胞因子恢復到健康水平，并且沒有觀察到嚴重的長期副作用。
因此，作者認為此聯(lián)合療法能夠顯著緩解纖維化，并且可使免疫系統(tǒng)向健康狀態(tài)整體回歸，同時實現(xiàn)良好的耐受性�；蛟S在未來，這種新療法有可能取代類固醇單一療法來治療RPF。
1. mTOR 途徑在 RPF 中被高度激活
作者在搜索基因-疾病-藥物數(shù)據(jù)庫后，鑒定到了一些富含細胞毒性/激酶途徑和細胞因子/趨化因子途徑的基因（調(diào)整后的 p<0.05），對所有基因的匯總分析后，揭示了關鍵信號通路，包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 通路及其相關的phosphoinositide-3-kinase (PI3K)- Akt 通路。為了驗證此發(fā)現(xiàn)，作者利用mTOR 及其兩個直接下游信號分子，mTOR-complex 1 中的phospho-S6K (p-S6K) 和 mTOR-complex 2 中的phospho-AKT (p-Akt)進行免疫組化染色：以纖維化最密集并伴有T細胞和B細胞高度浸潤的纖維組織中心(GCs)，以及靠近GCs的外周組織作為實驗組，以非纖維化組織作為對照。結果顯示在GCs或外周觀察到>90% 的細胞被mTOR染色。p-S6K在對照組中染色程度較低，在GCs中染色程度較高；相比之下，p-Akt 在對照組和實驗組中的結果不明顯。因此，得出結論，mTOR-complex 1 在纖維化組織中被高度激活。
圖1 PI3K-AKT- mTOR通路在RPF組織中高度激活
2. RPF癥狀通過聯(lián)合治療得到改善
通過聯(lián)合治療，大多數(shù)RPF癥狀顯示出改善。CT掃描顯示，在12周和48周的治療中，纖維化組織的軸向直徑和厚度都縮小了近一半。兩個急性炎癥的標志物，CRP和ESR，減少了70%-80%。腎臟功能的兩個標志物，Scr和eGFR，在治療過程中也顯示出持續(xù)的改善。聯(lián)合治療還緩解了RPF患者的貧血癥狀，血紅蛋白濃度提高了約12%。研究還發(fā)現(xiàn)，治療后IgG4下降了40%-50%，這表明它對治療IgG4+RPF 也有效�；诖爽F(xiàn)象作者還分析了免疫球蛋白的其他類型，發(fā)現(xiàn)除IgG在治療過程中明顯減少外，IgE、IgM和IgA并沒有顯示出明顯的變化。
圖2 實驗測試評估強的松和西羅莫司聯(lián)合治療RPF的治療效果
3. 免疫細胞類型和豐度情況
作者通過流式細胞術對外周血中的七個T細胞亞群進行了全面的免疫表型分析。在治療過程中，觀察到TH2，TH17 和cTFH 細胞豐度減少，但 TH1 未見變化。TH2，TH17細胞分別是產(chǎn)生 IL-4 和產(chǎn)生 IL-17 的 CD4+T 細胞，并且cTFH 細胞在GCs的發(fā)育和抗體生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。
圖3 流式細胞術免疫譜分析顯示，特異性T細胞亞群受治療調(diào)節(jié)
4. 利用olink技術檢測治療過程中的炎癥蛋白的豐度
作者使用96-plex inflammatory panel進行靜脈血中蛋白進行檢測，共鑒定了 75 種蛋白。25 種蛋白質(zhì)顯示出相對于對照組的疾病狀態(tài)變化，包括腫瘤壞死因子 (TNF)、白細胞介素和趨化因子（t 檢驗，調(diào)整后的 p<0.05）。治療后，其中 6 種恢復到健康水平，即 CCL23 、OSM 、TNF 、TNFRSF9 、TRAIL 和VEGFA。值得注意的是，RPF 中大多數(shù)處于健康水平的蛋白質(zhì)在治療結束時仍保持穩(wěn)定（t 檢驗，調(diào)整后的 p<0.05）。也有少部分蛋白質(zhì)，例如AXIN1、CCL20、CXCL1、CXCL5、FGF-2和SIRT2在疾病狀態(tài)下表現(xiàn)正常，但在治療后偏離正常，這些變化有可能歸因于藥物副作用（75 人中有 6 人，8%）。作者對25種對治療有反應的炎癥蛋白進行了 KEGG 通路富集，發(fā)現(xiàn)它們大多富集在細胞因子、趨化因子和其他免疫相關信號通路中（圖 4B).
圖4 Olink Target 96炎癥panel進行細胞因子分析
基于以上研究，將逐漸減少劑量的潑尼松與長期穩(wěn)定劑量的mTOR 抑制劑西羅莫司相結合的治療策略被證明可有效治療腹膜后纖維化（RPF）。由于目前單一長期類固醇激素的 RPF 治療通常會導致嚴重的副作用，這一新療法有可能取代類固醇單一療法，為新的治療方向帶來希望。
參考文獻：
Gao H, Liu S, Mai Y, Wang Y, Zhang X, Zheng S, Luo C, Pan C. Combined therapy of prednisone and mTOR inhibitor sirolimus for treating retroperitoneal fibrosis. Ann Rheum Dis. 2023 Jan 31:ard-2022-223736. doi: 10.1136/ard-2022-223736. Epub ahead of print. PMID: 36720581.
