2022年7月11日，浙江大學(xué)郭國驥/韓曉平教授團(tuán)隊(duì)在國際權(quán)威期刊Nature Genetics (IF=41.3069) 上發(fā)表了題為“Systematic identification of cell-fate regulatory programs using a single-cell atlas of mouse development”的最新成果，研究從單細(xì)胞水平上構(gòu)建了小鼠發(fā)育過程中譜系分化的細(xì)胞圖譜，結(jié)合4D蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，描繪了小鼠譜系發(fā)育和成熟過程的細(xì)胞狀態(tài)流形圖，并揭示了控制細(xì)胞命運(yùn)決定的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

 

文章概述

該研究在單細(xì)胞水平構(gòu)建了發(fā)育過程中小鼠譜系分化的細(xì)胞圖譜，并描述了細(xì)胞類型成熟過程中譜系共同和譜系特異性調(diào)節(jié)程序。還發(fā)現(xiàn)在無脊椎動物和脊椎動物的發(fā)育過程中廣泛活躍的譜系共同調(diào)節(jié)程序。特別是，確定了Xbp1是不同物種細(xì)胞命運(yùn)決定的進(jìn)化保守調(diào)節(jié)因子。證明了Xbp1轉(zhuǎn)錄調(diào)控對于穩(wěn)定多種小鼠細(xì)胞類型的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常重要。該研究結(jié)果為細(xì)胞基因調(diào)控程序提供了遺傳和分子方面的見解，并將作為進(jìn)一步推進(jìn)細(xì)胞命運(yùn)決策理解的基礎(chǔ)。

 

研究結(jié)果

• 小鼠細(xì)胞分化圖譜（MCDA）的構(gòu)建

作者對小鼠從早期胚胎階段到成熟成年階段的七個生命階段進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析：胚胎期（E）10.5、E12.5、E14.5、出生后（P）0、P10、P21和成年。共分析了520000多個單細(xì)胞（圖1b）。包括分布在不同系統(tǒng)中的器官：大腦、心臟、腸道、腎臟、肝臟、肺、胰腺、胃、睪丸和子宮。對每個組織相鄰階段的差異表達(dá)基因（DEG）的分析表明，不同階段的組織成熟臨界期不同。從P0和P10樣本中觀察到許多不同的亞群，表明出生后細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)變。

圖1 小鼠分化的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜

 

• 小鼠發(fā)育過程中的細(xì)胞變化

以腎臟的動態(tài)變化為代表進(jìn)行研究。分析從E10.5至成人階段的腎臟樣本，定義了30個具有典型標(biāo)志物的聚類，其中包括基質(zhì)細(xì)胞、腎單位上皮細(xì)胞、開窗內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞（圖2a）。值得注意的是，UB細(xì)胞和NPC包括P0期的細(xì)胞，而遠(yuǎn)端和近端SSB細(xì)胞包括P10期的細(xì)胞（圖2b）。這一結(jié)果表明，小鼠的腎臟生成在出生后繼續(xù)，而不是在出生前完成。此外，腎功能的成熟持續(xù)到成年階段，并逐漸發(fā)生生理變化。

為了揭示發(fā)育過程中小鼠組織中的細(xì)胞異質(zhì)性，對不同階段的每個組織進(jìn)行了t-SNE和差異基因表達(dá)分析。發(fā)現(xiàn)了37個先前未被識別的細(xì)胞群體，它們具有與小鼠發(fā)育相關(guān)的有趣的基因表達(dá)模式。鑒定了在P0階段在腸和腦中共同表達(dá)肌細(xì)胞（Myl9，Acta2）和內(nèi)皮細(xì)胞（Esam，Gng11）標(biāo)記物的細(xì)胞（圖2c，d）。Myl9和Esam的共同免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)了scRNA-seq結(jié)果（圖2e，f）。

總之，具有共表達(dá)或異位表達(dá)模式的祖細(xì)胞池可能廣泛存在于發(fā)育中的器官中，這提示了哺乳動物在終末分化前的狀態(tài)多樣性的復(fù)雜性。

圖2 小鼠組織中的細(xì)胞異質(zhì)性

 

• MCDA中調(diào)控機(jī)制的表征

為了識別細(xì)胞身份的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（TFs），利用數(shù)據(jù)驅(qū)動（SCENIC）32和數(shù)據(jù)庫衍生（VIPER-DOROTHEA）方法來估計TF的活性�；�于單細(xì)胞數(shù)據(jù)集，檢測組織特異性TF的靈敏度達(dá)到>75%。確定了900多個TF，置信水平從A（高置信度）到C（低置信度）。結(jié)果表明，這些譜系共同TF在一系列小鼠細(xì)胞類型的成熟過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

圖3 MCDa中調(diào)控機(jī)制的分析

 

• 跨物種細(xì)胞命運(yùn)決定過程中的全局特征

了探索跨物種發(fā)育中的常見變化，進(jìn)行了熵分析，發(fā)現(xiàn)所有七個物種的熵隨著發(fā)育而降低，這表明轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性的增加在進(jìn)化上是保守的（圖4a-f）。發(fā)育過程中下調(diào)的基因富含核糖體蛋白質(zhì)基因、線粒體核糖體蛋白基因和小核核糖核蛋白基因（圖4g）。值得注意的是，Myc和Mycn作為核糖體生物發(fā)生的調(diào)節(jié)劑，在小鼠發(fā)育的早期階段顯示出高活性分?jǐn)?shù)（圖4h）。結(jié)果表明，核糖體蛋白質(zhì)基因是干細(xì)胞的一個保守特征，在細(xì)胞類型分化過程中它們被下調(diào)。另一方面，上調(diào)基因在免疫途徑中高度富集，這與最近關(guān)于人和小鼠成體組織的報告一致。介紹了從無脊椎動物到脊椎動物的譜系發(fā)育過程中的一系列共同特征；特定的核糖體蛋白基因在分化程度較低的細(xì)胞中富集。

圖4 跨物種細(xì)胞分化的全局特征

 

• 跨物種細(xì)胞命運(yùn)決定的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

對于不同物種間的譜系共同調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)幾種常見上調(diào)的TF表現(xiàn)出顯著的收斂性，包括XBP1、JUND、FOSB、JUN、BHLHE40和其他（圖5a），與各種成年小鼠組織中的富集TF一致（圖3c）。這些TF還與人類細(xì)胞圖譜（HCL）中富含譜系特異性祖細(xì)胞（GATA1、PAX6、NKX6-2、NEUROD1、SOX10、OLIG2）的TF表現(xiàn)出強(qiáng)烈的負(fù)相關(guān)，HCL是由Microwell-seq14生成的人類綜合細(xì)胞圖譜（圖5b）。懷疑這些TF可能作為進(jìn)化上保守的調(diào)節(jié)因子，引導(dǎo)多系細(xì)胞分化和成熟。作者發(fā)現(xiàn)，在所有七種物種中，只有一種TF Xbp1突出（圖5a）。作為一種假定的共同調(diào)節(jié)因子，Xbp1顯示了大多數(shù)MCDA譜系中的上調(diào)表達(dá)模式（圖5c）。從細(xì)胞圖譜的角度進(jìn)一步剖析了其調(diào)節(jié)作用，并發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞調(diào)節(jié)因子如SOX4、SON和HES1與HCL中的XBP1最負(fù)相關(guān)（圖5d）。此外，在使用小鼠和人類（圖5e，f）的測序（scATAC seq）數(shù)據(jù)進(jìn)行的轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)單細(xì)胞分析中，造血祖細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞中的XBP1結(jié)合基序的富集程度低于其相應(yīng)的成熟細(xì)胞類型。

圖5 跨物種細(xì)胞命運(yùn)決定過程中基因調(diào)控的推斷

 

• Xbp1作為多譜系進(jìn)展中的常見調(diào)節(jié)因子

Xbp1的破壞導(dǎo)致小鼠胚胎獲得更多祖細(xì)胞狀態(tài)。了表征蛋白質(zhì)水平的功能喪失變化，對WT和敲除（KO）胚胎進(jìn)行了液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）蛋白質(zhì)組學(xué)分析。Xbp1−/−胚胎表現(xiàn)出更高表達(dá)水平的多能相關(guān)蛋白，如Lin28a、Lin28b、Pcgf6和Jarid2，以及更低表達(dá)水平的細(xì)胞類型特異性蛋白，如神經(jīng)細(xì)胞中的Snca、基質(zhì)細(xì)胞中的Clu、肝細(xì)胞中的Afp、巨噬細(xì)胞中的C1qb和紅系細(xì)胞中的Blvrb（圖6f）。

圖6 ScRNa序列和高分辨率質(zhì)譜顯示Xbp1−/−胚胎中的基因和蛋白質(zhì)變化

 

總結(jié)

研究從單細(xì)胞水平上構(gòu)建了小鼠發(fā)育過程中譜系分化的細(xì)胞圖譜，結(jié)合4D蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，描繪了小鼠譜系發(fā)育和成熟過程的細(xì)胞狀態(tài)流形圖，并揭示了控制細(xì)胞命運(yùn)決定的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

 

參考文獻(xiàn)：

Fei L, Chen H, Ma L, E W, Wang R, Fang X, Zhou Z, Sun H, Wang J, Jiang M, Wang X, Yu C, Mei Y, Jia D, Zhang T, Han X, Guo G. Systematic identification of cell-fate regulatory programs using a single-cell atlas of mouse development. Nat Genet. 2022 Jul;54(7):1051-1061. doi: 10.1038/s41588-022-01118-8. Epub 2022 Jul 11. Erratum in: Nat Genet. 2022 Aug 3;: PMID: 35817981.