由于細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)在疾病診斷以及治療領(lǐng)域的巨大潛力，被視為液體活檢和藥物遞送的明日之星。圍繞這些小囊泡的基礎(chǔ)研究持續(xù)升溫，在工業(yè)界亦是炙手可熱。但是，EVs的來源環(huán)境往往極其復(fù)雜，如細(xì)胞培養(yǎng)上清、血液、尿液以及腹水等生物體液，其自身在粒徑、組成成分等方面與雜質(zhì)顆粒存在重疊，如何從復(fù)雜環(huán)境中純化得到高質(zhì)量的EV樣本，一直是該領(lǐng)域面臨的重要挑戰(zhàn)。

目前在血漿等體液來源外泌體的研究中，差速離心結(jié)合密度梯度離心的方法是當(dāng)前最廣泛使用的高純度外泌體分離方法。但該方法耗時(shí)長、操作繁瑣、難以平衡顆粒得率和產(chǎn)物質(zhì)量且過高的離心力不可避免地對EV的完整性和組成成分造成不同程度的影響。因此，這些因素限制了該方法向臨床應(yīng)用和工業(yè)界的轉(zhuǎn)化。

近日，來自德國馬爾堡大學(xué)腫瘤免疫研究中心的Strandmann教授團(tuán)隊(duì)及合作者們在《J Extracellular Bio》上發(fā)表了題為“Isolation of native EVs from primary biofluids—Free-flow electrophoresis as a novel approach to purify ascites-derived EVs”的研究型文章，開發(fā)了一種從復(fù)雜的生物體液樣本中高效分離純化EVs的新方法。
 

由于磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)和表面高豐度的糖基化蛋白，EVs的表面電勢通常表現(xiàn)為負(fù)電勢(zeta電位)，而脂蛋白及蛋白團(tuán)聚體等雜質(zhì)顆粒主要表現(xiàn)為正電勢。基于EV與雜質(zhì)顆粒的固有電荷密度或等電點(diǎn)的差異，作者利用自由流動電泳技術(shù)(free-flow electrophoresis, FFE)，并通過優(yōu)化分離純化緩沖液的pH值、分離介質(zhì)、電導(dǎo)率和電壓等條件，開創(chuàng)性地發(fā)展了一種從富含蛋白顆粒及其他生物大分子的生物體液（如腹水）中高效純化EVs的方法。該方法具有分離通量高和速度快等優(yōu)點(diǎn)，在6小時(shí)內(nèi)即可完成100個(gè)樣本的分離純化，有望用于臨床樣本中EVs的分離，加速EVs的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。
 

圖1. FFE設(shè)備原理概述及工作流程

如圖1所示，加載到樣品入口的預(yù)分離樣本通過縱向流運(yùn)輸在垂直電場中分離。樣本中不同顆粒在電場內(nèi)的遷移速度取決于它們的等電點(diǎn)和分離區(qū)分離緩沖液的pH值。同時(shí)，為了避免樣本接觸電極，作者使用了較高pH值的穩(wěn)定緩沖液對電極進(jìn)行包裹。待完成樣本的分離后，再使用相應(yīng)緩沖液通過逆向流的方式將樣本的pH調(diào)整為中性。通過與分離室相連的毛細(xì)管，即可將分離后的各組分收集在96孔板中。隨后，作者以國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會提出的MISEV為準(zhǔn)繩，對所得的EVs樣本，從粒徑、濃度、純度、生化性質(zhì)等多個(gè)維度進(jìn)行了系統(tǒng)性評估。
 

圖2. 基于免疫印跡的FFE分離所得EV樣本的蛋白分析

首先，通過免疫印跡方法對腹水來源EVs的標(biāo)志蛋白(ALIX和flotillin-1)、脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白(如HDL標(biāo)記物-ApoA和ApoE-乳糜微粒/VLDL標(biāo)記物)以及囊泡常見污染物主要蛋白(calnexin)進(jìn)行了分析。如圖2所示，ALIX和flotillin-1在分離得到的三個(gè)主要組分(F17-19)中被富集，而calnexin則完全沒有被檢測到。腹水中大量存在的脂蛋白ApoA、ApoE則用于評估最終EVs產(chǎn)品中的蛋白殘留情況。該方法完全去除了腹水樣本中高含量的Apo A蛋白。雖然在F18和F19中有檢測到Apo E，但也有研究發(fā)現(xiàn)Apo E與EV相關(guān)。
 

圖3. 基于電鏡及NanoFCM的EVs單顆粒表征

進(jìn)一步采用TEM以及NanoFCM對純化所得樣本在單顆粒水平進(jìn)行了分析(圖3)。TEM結(jié)果顯示，F(xiàn)FE法分離得到的EVs中沒有觀察到典型的蛋白質(zhì)團(tuán)聚體以及脂質(zhì)顆粒等污染。NanoFCM則進(jìn)一步揭示了EV經(jīng)典標(biāo)志蛋白CD9、CD63和CD81的表達(dá)情況，其中CD9的陽性比例最高，可達(dá)56.1%，CD81和CD63的陽性比例分別為19.8%和13.0%，而CD9和CD63雙陽性的比例僅為12%。作者還發(fā)現(xiàn)有15.2%的EVs表面有表達(dá)上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM，提示該部分EVs可能來源于腫瘤細(xì)胞。NanoFCM進(jìn)一步揭示四聯(lián)體跨膜蛋白陽性EVs的粒徑中位值為77 – 89 nm，而EpCAM陽性EVs的粒徑相對更大，中位值為95 nm。

結(jié)論
Strandmann教授團(tuán)隊(duì)及其合作者結(jié)合免疫印跡、TEM和NanoFCM等多種表征方法，通過對FFE法進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了從組成成分高度復(fù)雜的體液樣本中快速、高通量地分離純化得到EVs。結(jié)合NanoFCM檢測平臺，有望進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)EVs相關(guān)生物標(biāo)志物的檢測，從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用均展現(xiàn)出巨大潛力。

參考文獻(xiàn)
·Van Niel, G., Bergam, P., Di Cicco, A. et al.(2015). Apolipoprotein E regulates amyloid formation within endosomes of pigment cells. Cell Reports, 13, 43–51.

·Preußer, C., Stelter, K., Tertel, T. et al.(2022). Isolation of native EVs from primary biofluids—Free-flow electrophoresis as a novel approach to purify ascites-derived EVs. Journal of Extracellular Biology, 1, e71.