化合物篩選是高通量篩選的主要也是基本用途，這種用途一般會(huì)結(jié)合前期機(jī)制研究 (如生信分析，基因組學(xué)或蛋白組學(xué)等進(jìn)行靶點(diǎn)鑒定)，針對(duì)鑒定的靶點(diǎn)篩選相應(yīng)抑制劑或激動(dòng)劑，這種篩選模式我們稱為基于靶點(diǎn)的篩選 (target-based screening)；此外，也可基于當(dāng)前研究疾病，直接構(gòu)建相應(yīng)疾病模型，再利用高通量篩選技術(shù)，篩選針對(duì)某種疾病表型的化合物，這種篩選模式我們稱為基于表型的篩選 (Phenotypic -based screening)^[1]。不管基于哪種篩選模式，最終目的是為了找到能夠?qū)δ撤N疾病具有治療價(jià)值的小分子化合物。上實(shí)例

 

纖維性疾病幾乎影響到身體的每一個(gè)組織，這種疾病的發(fā)生發(fā)展會(huì)迅速導(dǎo)致器官功能障礙、器官衰竭，最終導(dǎo)致死亡。成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 的大量沉積 (I 和 V 型膠原作為標(biāo)志物) 是纖維化疾病的標(biāo)志。 目前臨床可供使用的抗纖維化的藥物相對(duì)缺乏。2021 年，由 MichaelGerckens 等人開發(fā)了一種基于表型篩選開發(fā)新型抗纖維化藥物的方法，并鑒定出一系列具有較高活性的抗纖維化化合物^[2]。 

■ 篩選模型建立

首先作者建立了一種深度學(xué)習(xí)模型 (deep learning model)，可以對(duì)高通量顯微成像獲得的數(shù)千張細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 免疫染色圖片進(jìn)行批量分析，以確定具有改善纖維化狀態(tài)的先導(dǎo)化合物。

 

圖 1. 提取自特發(fā)性肺纖維化患者的人原代肺纖維化細(xì)胞，在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，用于高通量篩選模型^[2]

 

■ 高通量篩選

在 100 μM 濃度下，使用MCE FDA 批準(zhǔn)上市庫進(jìn)行篩選，通過顯微成像技術(shù)，最終得到 16 種陽性化合物 (圖 2a) 中，其中 Tranilast 在抑制基質(zhì)沉積方面表現(xiàn)出良好的效果，并呈現(xiàn)出劑量依賴性 (圖 2b) ，并且已有文獻(xiàn)表明 Tranilast 在體內(nèi)具有較好的生物利用度、安全性和耐受性的安全性，最終選定 Tranilast 作為先導(dǎo)化合物。

 

圖 2. 先導(dǎo)化合物的確認(rèn)^[2]

圖 3.Tranilast 對(duì) ECM 沉積表現(xiàn)出濃度依賴的抑制作用^[2]

■ 構(gòu)效關(guān)系分析及先導(dǎo)化合物優(yōu)化

由于篩選到的 Tranilast 需要在較高濃度 (>150 μM) 下才會(huì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗纖維化活性，所以作者還對(duì) Tranilast 做了進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化，希望從 Tranilast 結(jié)構(gòu)類似物中篩選到具有更高活性的產(chǎn)品 (圖 4a)。通過對(duì)Tranilast結(jié)構(gòu)類似物及合成的一系列結(jié)構(gòu)類似物做進(jìn)一步篩選，得到一系列 N-(2-butoxyphenyl)-3-(phenyl)acrylamides (N23Ps)，部分 N23Ps 具有較高的抗纖維化活性，抑制 ECM 沉積的 IC₅₀ 數(shù)值在 10 μM 以下 (圖 4b)。

圖 4. Tranilast 及 N23Ps 結(jié)構(gòu)^[2]

■ N23Ps 作用機(jī)制研究

基上述活性篩選，作者團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步進(jìn)行了機(jī)制驗(yàn)證；他們對(duì)纖維化組，纖維化+ N23Ps 組 (給藥組) 及空白組進(jìn)行芯片轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)一系列蛋白表達(dá)調(diào)控差異。通過對(duì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析及基因功能關(guān)系分析，鑒定出 E3 連接酶 SMURF2 (TGFβ1 信號(hào)通路中重要的胞內(nèi)信號(hào)因子) 可能參與了 N23Ps 對(duì)抗纖維化的調(diào)控。 

圖 5. 通過轉(zhuǎn)錄組分析及基因功能關(guān)系分析探究 N23Ps 作用機(jī)制^[2]

為了深入了解 N23P 調(diào)節(jié) TGFβ1 依賴性肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制，使用 SMURF2 siRNA 敲低進(jìn)行了功能丟失研究。cmp4 處理顯著抑制 TGFβ1 處理的 IPF-phLFs 中 αSMA 蛋白的表達(dá); 但這種抑制在 SMURF2 缺失的 phLFs+TGFβ1+cmp4 的肌成纖維細(xì)胞中被阻止 (圖 6)，這表明 N23Ps 確實(shí)會(huì)通過 SMURF2 抑制的 TGF-β 通路參與抗纖維化調(diào)控。 

圖 6. N23Ps 可能的作用機(jī)制通路^[2]

除了上述應(yīng)用，活性化合物庫由于具有明確的靶點(diǎn)及作用機(jī)制，常被用來進(jìn)行機(jī)制研究。通過高通量篩選對(duì)得到的先導(dǎo)化合物進(jìn)行靶點(diǎn)及作用機(jī)制的聚類分析，可以推測(cè)哪些靶點(diǎn)或通路可能參與了疾病調(diào)控，通過進(jìn)一步驗(yàn)證，可以揭示一些新的作用機(jī)制或靶點(diǎn)。一次篩選，相當(dāng)于指明了后續(xù)研究方向。下面我們通過一篇 Claudia Capparelli 等科學(xué)家今年發(fā)表在 Nature Communications 上的文章為例看一下如何利用高通量篩選技術(shù)進(jìn)行機(jī)制探究的^[3]。

■ 研究背景

SOX10 是黑色素瘤細(xì)胞中異質(zhì)性表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄因子，SOX10 的缺失會(huì)降低細(xì)胞增殖，導(dǎo)致侵襲性，并促進(jìn)對(duì) BRAF 和/或 MEK 抑制劑的耐受性。為了解決藥物耐受問題，尋找能誘導(dǎo) SOX10 缺陷細(xì)胞死亡的藥物，Claudia Capparelli 等人對(duì) MCE 抗腫瘤化合物庫進(jìn)行篩選。

■ 篩選模型建立

■ 機(jī)制探究
緊接著，為了驗(yàn)證上述推測(cè)，進(jìn)行了蛋白表達(dá)分析及基因組學(xué)分析，結(jié)果表明 cIAP2 表達(dá)與 SOX10 表達(dá)成負(fù)相關(guān)，cIAP2 參與誘導(dǎo) SOX101 缺陷細(xì)胞死亡 (圖 8)，并找到了治療 RAF 和/或 MEK 抑制劑耐藥性的有效方案，即在 BRAFi 和 MEKi 方案中加入 cIAP1/2 抑制劑將延遲獲得性耐藥的發(fā)生。 

圖 8. SOX10 缺失在黑色素瘤中的調(diào)控機(jī)制^[3]

對(duì)于機(jī)制或表型復(fù)雜的疾病，篩選之前開發(fā)合適的篩選模型是實(shí)驗(yàn)的重中之重，化合物庫可以用于新開發(fā)篩選模型的驗(yàn)證。如 Jong-ChanPark 等科學(xué)家報(bào)道的一個(gè)基于信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的高效阿爾茨海默病 (AD) 藥物篩選平臺(tái)，提出了數(shù)學(xué)建模和人類 iCO相結(jié)合的精準(zhǔn)醫(yī)療策略^[4]。

 

為了建立該平臺(tái)，作者團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了三個(gè)步驟：(i) 從 AD 參與者中生成 iPSC 衍生的類器官 (iCO) (源于 11 名參與者的 1300 個(gè)類器官被用于藥物評(píng)估平臺(tái))。(ii) 通過對(duì)神經(jīng)元分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析，提出了考慮神經(jīng)元?jiǎng)討B(tài)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行了基于系統(tǒng)生物學(xué)的AD路徑數(shù)學(xué)模擬 (包含信令網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、網(wǎng)絡(luò)模型驗(yàn)證、控制節(jié)點(diǎn)識(shí)別等步驟)。(iii)利用該篩選平臺(tái)對(duì)MCEFDA庫中的可透過血腦屏障化合物進(jìn)行篩選,并通過高內(nèi)涵篩選 (HCS) 成像系統(tǒng)定量 AD 發(fā)病程度, 驗(yàn)證了所建立的篩選模型的可行性，并得到一系列在 AD 治療方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值的藥物。

圖 9. AD 藥物篩選平臺(tái)建立方案^[4]

高通量篩選技術(shù)已經(jīng)不再是制藥領(lǐng)域的專屬工具，它已經(jīng)逐漸成為科研領(lǐng)域進(jìn)行基礎(chǔ)研究的重要工具。除了先導(dǎo)化合物的篩選，化合物新功能探究及疾病機(jī)制的研究等，對(duì)于某些機(jī)制或表型復(fù)雜的疾病，運(yùn)用高通量篩選技術(shù)先建立合適的篩選模型是實(shí)驗(yàn)的重中之重。相信高通量篩選技術(shù)將為學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)在這方面研究發(fā)揮越來越大的推動(dòng)作用。

 

相關(guān)產(chǎn)品

生物活性化合物庫 MCE收錄了15000+ 種具有明確報(bào)道的、活性已知、靶點(diǎn)明確的小分子化合物，包括天然產(chǎn)物，新型化合物，已上市化合物及處于臨床期化合物等，可以用于信號(hào)通路研究，新藥研發(fā)，老藥新用等不同的篩選目的。

FDA 上市庫 MCE收錄了2600+ 個(gè)批準(zhǔn)上市的化合物，這些化合物已經(jīng)完成了廣泛的臨床前和臨床研究，具有良好的生物活性、安全性和生物利用度。

天然產(chǎn)物庫 MCE收錄了 3700+ 種天然產(chǎn)物，包括糖類和糖苷，苯丙素類，醌類，黃酮類，萜類，類固醇，生物堿，酚類，酸和醛等，天然產(chǎn)物化合物庫是一種有用的藥物開發(fā)工具。

片段化合物庫 MCE可以提供 17000+ 種片段化合物，這些化合物均符合“類藥 3 原則 (RO3)”，MCE 片段化合物庫是先導(dǎo)化合物的重要來源。

老藥新用化合物庫 MCE 老藥新用化合物庫包括 4000+ 種批準(zhǔn)上市藥物及臨床Ⅰ期以后化合物，這些化合物已經(jīng)完成了廣泛的臨床前和臨床研究，具有良好的生物活性、安全性和生物利用度，特別適合藥物新適應(yīng)癥的研究。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。

 

  

參考文獻(xiàn)

[1] Wei Zheng, etc. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 2013 Nov;18(21-22):1067-73. 
[2] Michael Gerckens, etc. Phenotypic drug screening in a human fibrosis model identified a novel class of antifibrotic therapeutics. Sci Adv. 2021 Dec 24;7(52):eabb3673. 
[3] Claudia Capparelli, etc. Targeting SOX10-deficient cells to reduce the dormant-invasive phenotype state in melanoma. Nat Commun. 2022 Mar 16;13(1):1381. 
[4] Jong-Chan Park, etc. A logical network-based drug-screening platform for Alzheimer's disease representing pathological features of human brain organoids. Nat Commun. 2021 Jan 12;12(1):280.