Cre-lox系統(tǒng)雖然能有效幫助我們在特定的組織中進(jìn)行基因敲除，但Cre重組酶表達(dá)的時間是由其啟動子決定的。如果你希望在特定時間段人為操縱Cre重組酶的活性，比如說要研究某個基因在小鼠發(fā)育特定時期的功能，應(yīng)該怎么辦呢？今天J博士將介紹一種時空特異性敲除系統(tǒng)：Tamoxifen誘導(dǎo)型CreER重組酶。

01 什么是CreER重組酶

為了給Cre-Lox系統(tǒng)的加上可誘導(dǎo)的屬性，研究者開發(fā)了配體依賴的CreER重組酶。

它由cre重組酶與雌激素受體(estrogen receptor, ER)的激素結(jié)合域相融合組成。在沒有雌激素類似物Tamoxifen的作用下，CreER重組酶停留在細(xì)胞質(zhì)中，無法發(fā)揮功能；只有在與雌激素結(jié)合的條件下，CreER才可以進(jìn)入細(xì)胞核中驅(qū)動LoxP位點發(fā)生重組。目前為止，CreER系統(tǒng)已經(jīng)改進(jìn)成雌激素結(jié)合域攜帶G400V/M543A/L544A三位點突變的CreERT2重組酶系統(tǒng)，其在無誘導(dǎo)物的情況下降低了本底活性，并同時提高了Tamoxifen的敏感性和效率。

02  Tamoxifen的配制和使用劑量

如何配制和使用Tamoxifen，是CreER系統(tǒng)開展實驗中不可避免會遇到的問題。針對這一點，J博士總結(jié)了一些常用的方法供大家參考。

需要注意的是，不同的實驗設(shè)計、不同的小鼠品系以及不同的分析方法對于前期實驗的要求往往有所差異，包括給藥劑量、給藥頻率和方式等。因此，下述方法只是一個參考，在實驗過程中往往還應(yīng)根據(jù)參考文獻(xiàn)、實驗經(jīng)驗設(shè)計預(yù)實驗，以確定最佳方案。

▲ Tamoxifen的配制

將Tamoxifen溶解在玉米油中，終濃度為20 mg/ml，并在37 ℃下?lián)u晃過夜。需注意Tamoxifen對光敏感，在制備和儲存過程中需要避光處理。Tamoxifen溶解后可短暫保存于4 ℃，長期保存需存放在-20 ℃。

▲ Tamoxifen使用劑量

Tamoxifen可以通過腹腔注射、灌胃、飲食/飲水等方式進(jìn)行給藥，不同的方法所需要注意的點不盡相同。

① 腹腔注射給藥

● 優(yōu)：劑量精準(zhǔn)

● 缺：對小鼠壓力大，需要熟練操作

成年鼠誘導(dǎo)時需按體重確定注射劑量，約75 mg/kg小鼠體重。每24小時注射一次，連續(xù)2~5天，在最后一次注射結(jié)束后7天便可開展后續(xù)實驗。

● 對于需要胚胎期誘導(dǎo)的小鼠，可以對孕鼠按上述劑量進(jìn)行1~2天Tamoxifen腹腔注射。但是需注意Tamoxifen會影響胎兒發(fā)育和生產(chǎn)，誘導(dǎo)的時間盡量選擇孕晚期，并同時注射孕酮來減少流產(chǎn)概率。

● 除以上建議的劑量以外，J博士還整理了部分文獻(xiàn)中對孕鼠和新生小鼠給藥方式^[1]，供大家參考使用：

② 灌胃給藥

● 優(yōu)：較飲食/飲水而言劑量準(zhǔn)確，較腹腔注射而言對小鼠壓力小

● 缺：操作耗費時間，同樣需要熟練操作

● 同樣需要按體重給藥，約75 mg/kg小鼠體重，每24小時灌胃一次，連續(xù)5天。

③ 飲食/飲水給藥

● 優(yōu)：對小鼠造成壓力最小

● 缺：易受小鼠飲食習(xí)慣影響，且在水中溶解度低，誘導(dǎo)時間需較長

● 與腹腔注射和灌胃相比，飲食/飲水需要長達(dá)幾周的誘導(dǎo)時間，在此期間體重也可能會比正常水平下降10%~15%。

注意事項

● Tamoxifen不溶于水，需溶于酒精和玉米油中。

● 對照組小鼠需要同步進(jìn)行不含Tamoxifen的玉米油溶液給藥。

● Tamoxifen處理組和未處理小鼠應(yīng)該分籠飼養(yǎng)，舐舔Tamoxifen懸浮液、梳毛或吞食行為可能會導(dǎo)致Tamoxifen意外攝入并誘導(dǎo)敲除。