神經(jīng)退行性疾病是影響全球數(shù)百萬人的高度致殘且最終致命的疾病，主要包括肌萎縮側(cè)索硬化癥 (Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、帕金森病 (Parkinson's disease, PD)、阿爾茨海默癥 (Alzheimer's disease, AD) 和亨廷頓病  (Huntington's disease, HD)。在神經(jīng)退行性疾病中，特定的神經(jīng)元亞群，例如多巴胺能和膽堿能神經(jīng)元或運動神經(jīng)元會逐漸退化，導(dǎo)致特定模式的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。傳統(tǒng)藥物治療用于延緩疾病進(jìn)展，不能使功能修復(fù)或組織再生^[1]。

 

神經(jīng)干細(xì)胞 (Neural stem cells, NSCs) 在神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性、衰老、疾病和再生方面具有重要作用。基于體內(nèi)移植的 NSCs 具有自我更新、增殖、多向分化、低免疫原性和遷移的特點，NSCs 移植的成為了極具前景的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病療法，為腦損傷修復(fù)以及神經(jīng)性疾病的治療帶來了希望。

   

神經(jīng)干細(xì)胞 (NSCs) 被喻為中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 的 “種子” 細(xì)胞，不同神經(jīng)細(xì)胞系的產(chǎn)生起源于成體神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞命運的調(diào)控更是一個精細(xì)的過程，依賴于從表觀遺傳延伸到翻譯水平的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，且涉及細(xì)胞外基質(zhì)成分^[2]。

 

成體 NSCs 可以自我更新或響應(yīng)特定刺激分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞 (圖 1)，不同譜系的神經(jīng)細(xì)胞功能各異。

 

 

神經(jīng)元 (Neurons) 是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，通過軸突和樹突傳遞信號。典型的神經(jīng)元由樹突、細(xì)胞體、軸突 (包括軸突丘) 和突觸前末端組成。神經(jīng)元自身不能再生。移植外源性 NSCs 或動員內(nèi)源性 NSCs，使其分化為神經(jīng)元，重建損傷的神經(jīng)回路，是一種被廣泛探索的治療神經(jīng)退行性疾病的方法。 
 

星形膠質(zhì)細(xì)胞 (Astrocytes) 是中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 中最豐富的細(xì)胞類型，它們與神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞交流，并在結(jié)構(gòu)上支持它們生長，整合為三聯(lián)突觸和神經(jīng)血管單位，履行其功能。除了參與細(xì)胞通訊外，星形膠質(zhì)細(xì)胞還能通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，如膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF)，以及降低神經(jīng)元的興奮中毒，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

 

少突膠質(zhì)細(xì)胞 (Oligodendrocytes, OLGs) 是有髓鞘的膠質(zhì)細(xì)胞，對神經(jīng)元電絕緣、促進(jìn)跳躍信號傳導(dǎo)非常重要。少突膠質(zhì)細(xì)胞還通過髓磷脂膜為神經(jīng)元軸突提供代謝和營養(yǎng)支持，包括乳酸、丙酮酸和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF) 等神經(jīng)營養(yǎng)因子。

 
神經(jīng)干細(xì)胞，該如何培養(yǎng)？
 
可以通過三種不同的方法獲得 NSCs (圖 2)：(1) 從原發(fā)性 CNS 組織直接提取，包括腦和脊髓組織；(2) 分化多能干細(xì)胞，例如胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；(3) 轉(zhuǎn)分化體細(xì)胞，如皮膚成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞。從上述來源產(chǎn)生的 NSCs 可以通過基因改造，進(jìn)一步永生化^[1]。

 

 

如何有效地將 NSCs 誘導(dǎo)成特定的細(xì)胞類型? 神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子參與了 NSCs 增殖和分化的內(nèi)源性調(diào)控，已被證明能誘導(dǎo) NSCs 分化。目前已經(jīng)開發(fā)了不同的 NSCs 分化方案。大多數(shù)都是基于含有生長因子的培養(yǎng)基，NSCs 在其中粘附和增殖。這些生長因子包括成纖維細(xì)胞生長因子 (FGF) 和/或表皮生長因子 (EGF)、神經(jīng)生長因子 (NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF) 和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF) 等。

 

如在下文中，作者團隊發(fā)表了一種快速、高效的分化方法，通過使用含有必要生長因子的選擇性培養(yǎng)基從骨髓來源的細(xì)胞中生成小鼠 OLGs。通過該方案，可以在 7-8 周內(nèi)獲得成熟的 OLGs (與以前的工作相比，獲得 OLGs 的時間更短)。 

 

作者團隊的方法主要包括三個步驟: 骨髓來源的 NSCs 生成、NSCs-OPCs 分化和 OLGs 成熟^[4]。 

 

骨髓來源的 NSCs 生成：收集骨髓組織切小塊，消化，將細(xì)胞懸浮在無血清 DMEM/F12 中，添加 2% B27 補充劑， 20 ng/mL EGF 和 10 ng/mL bFGF ，同時添加 100 IU/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素。隨后將細(xì)胞懸浮在 NSC-PM (神經(jīng)干細(xì)胞增殖培養(yǎng)基)中，并包裹于含聚 D-賴氨酸和層粘連蛋白的 24 孔板。10-14 天后，形成類似神經(jīng)球的細(xì)胞團簇。

 

骨髓來源的 NSCs-OPCs 的分化和增殖：形成的神經(jīng)球被消化到單細(xì)胞中，在 NSC-PM 中培養(yǎng)。每個孔中的神經(jīng)球被消化成單細(xì)胞，在特定的 NSCs 分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

 

 
 
 
星形膠質(zhì)細(xì)胞分化時，DMEM 中添加 1% N2、2 mM GlutaMax-I 和 1% FBS。
OLGs 分化培養(yǎng)基添加 2% B27、2 mM GlutaMax-I 和 20 ng/mL T3 的 neuro 培養(yǎng)基。2 周后，分化培養(yǎng)基中的 NSCs 形態(tài)發(fā)生變化，并且能檢測到神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和 OLGs 的標(biāo)記物。
 

OLGs 成熟：在 OLGs 成熟過程中，用 DPBS 緩沖液洗去生長因子 (PDGF-AA 和 bFGF)，加入新鮮 EOLG-DM (早期 OLGs 分化培養(yǎng)基) 誘導(dǎo) OLGs 分化，然后將在EOLG-DM 培養(yǎng)基中生長 4 天的 OPCs 轉(zhuǎn)移到 LOLG-DM (晚期 OLGs 分化培養(yǎng)基) 中再生長 10 天，并通過添加 cAMP 加速 OLGs 分化的分支生長。

 

圖 3. 從小鼠自體骨髓來源的 NSCs 中生成少突細(xì)胞祖細(xì)胞 (OPCs) 和少突膠質(zhì)細(xì)胞^[4]

 

此外，越來越多的科研人員關(guān)注多種神經(jīng)營養(yǎng)因子/細(xì)胞因子聯(lián)合使用。Kyung-Chul Choi 教授團隊證明了生長因子的組合使用 (bFGF+IGF-I、bFGF+NGF、bFGF+BDNF、BDNF+IGF-I、bFGF+NGF) 對 NSCs 分化為神經(jīng)元的效果比單個生長因子 (bFGF、IGF-I、BDNF 和 NGF) 處理結(jié)果更顯著^[5]。

 
 
阿爾茨海默癥 (Alzheimer's disease, AD) 是一種神經(jīng)退行性疾病，由皮質(zhì)和皮質(zhì)下區(qū)域的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少引起，其發(fā)展主要與淀粉樣蛋白 (Aβ) 蛋白的積累和 Tau 蛋白的過度纏結(jié)相關(guān)。AD 的主要癥狀包括記憶力減退和認(rèn)知障礙，大部分患者為老年人。AD 不僅降低老年人的生活質(zhì)量，也加劇老齡化相關(guān)的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，因此，AD 的治療是眾多研究者重點關(guān)注的課題。
目前治療 AD 的常用藥物有多奈哌齊、卡巴拉汀、加蘭他敏、他克林4 種乙酰膽堿酯酶抑制劑，以及 1 種 NMDA 受體拮抗劑美金剛。但藥物無法再生已損傷或丟失的神經(jīng)元，對于已有明顯癥狀患者治療效果并不明顯。
NSCs 能夠自我更新并分化各種神經(jīng)細(xì)胞，NSCs 移植療法已顯示出治療 AD 的巨大潛力。移植后，NSCs 分化為神經(jīng)元和/或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并釋放營養(yǎng)因子，從而修復(fù) AD 引起的認(rèn)知障礙 (圖 4)。然而，盡管 NSCs 移植能再生神經(jīng)元，但對已產(chǎn)生的 Aβ 卻無法有效清除，這對移植后 NSCs 的存活也有不利的影響。對于 NSCs 的改造也是一個新興的研究課題。

圖 4. NSCs 移植途徑及認(rèn)知障礙修復(fù)機制：觸發(fā)內(nèi)源性突觸形成、內(nèi)源性神經(jīng)形成影響行為表現(xiàn)、調(diào)節(jié) Aβ 聚集^[6]

接下來小 M 來介紹一個在 APPswe/PS1dE9 雙轉(zhuǎn)基因小鼠中移植 NSCs 治療 AD 的例子~
 
蘇州納米所王強斌團隊開發(fā)了一種能夠穩(wěn)定和持續(xù)表達(dá)腦啡肽酶 (NEP) 的基因工程 NSCs。NSCs 經(jīng)改造后，在細(xì)胞膜上表達(dá)的 NEP 和釋放的胞外載體可持續(xù)降解 Aβ，提高 NSCs 和內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞的存活率。PPAR-siSOX9 納米制劑可通過協(xié)同調(diào)節(jié) Wnt/β-catenin 和 RA 信號通路來提高 NEP-NSC 的分化效率。
研究者們將改造的 PPAR-siSOX9 納米制劑-NEP-NSCs 立體定向移植到 APPswe/PS1dE9 雙轉(zhuǎn)基因 AD 小鼠模型的海馬體中(海馬體是大腦中最容易受到 AD 病理學(xué)損傷形成的區(qū)域)。與對照組相比，經(jīng)過治療后的 AD 小鼠具有更高活力和更高密度的神經(jīng)元，并且具有更高的存活率。治療一個月后，大腦中的病理性 Aβ 聚集的斑塊面積和大小也顯著降低 (圖 5)。在 Morris 水迷宮實驗中證明，納米制劑-NEP-NSCs 治療小鼠更頻繁地穿過平臺并在目標(biāo)象限中游泳的時間更長。這些結(jié)果表明，經(jīng)改造后的納米制劑-NEP-NSCs 在 AD 小鼠模型中能更有效地降解 Aβ 以及再生神經(jīng)元，逆轉(zhuǎn)了小鼠記憶與學(xué)習(xí)缺陷。
 

圖 5. NSCs 移植治療后 AD 小鼠大腦中 Aβ 定量檢測。G1：健康小鼠；G2：PBS 處理組；G3：NSC 治療組；G4：納米制劑-NSC 治療組；G5：NEP–NSC 治療組；G6：納米制劑-NEP-NSC 治療組^[7]

 
 
除了阿爾茨海默癥，在其他疾病如帕金森病 (PD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥 (ALS)、亨廷頓病 (HD)、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷 (TBI) 等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中，NSCs 移植也表現(xiàn)出巨大的潛力。

17038899, 27213850, 25022790, 18683244, 27562609, 25132189

 

相關(guān)產(chǎn)品

EGF 一種有效的有絲分裂因子，通過與細(xì)胞表面受體——表皮生長因子受體 (EGFR/ErbB) 的高親和力結(jié)合發(fā)揮作用。EGF 在眾多類型細(xì)胞的生長、增殖和分化中發(fā)揮著重要作用，常用于 NSCs 的增殖培養(yǎng)。

bFGF 一種內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的有效有絲分裂原，有廣泛的生物學(xué)功能，包括有絲分裂發(fā)生、細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)移形成，常用于 NSCs 的培養(yǎng)，bFGF 誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。

NGF NGF 是神經(jīng)營養(yǎng)因子中發(fā)現(xiàn)最早的因子，迄今為止研究最徹底，具有提供神經(jīng)元營養(yǎng)和促進(jìn)突觸生長的雙重生物學(xué)功能。

BDNF 一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，能夠與 TrkB 受體結(jié)合，調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育過程，包括神經(jīng)元的存活，分化，及突觸可塑性。BDNF 能刺激 NSCs 增殖，顯著增加 NSCs 向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化。

Neurotrophin-4 神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員，能夠與兩種不同受體結(jié)合，高親和性受體 TrkB 和低親和性受體  p75NTR。

Neurotrophin-3 在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)。NT-3 能促進(jìn) BM-NSCs 增殖和分化為膽堿能神經(jīng)元，并增加上清液中乙酰膽堿 (ACh) 的水平。

CNTF 一種多能性神經(jīng)營養(yǎng)因子，高濃度的CNTF通過 JAK-STAT 信號通路作用，將細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞。低濃度 CNTF 作為另一種神經(jīng)元誘導(dǎo)劑。這種誘導(dǎo)劑屬于造血細(xì)胞因子超家族，通過與 CNTF 受體 α (CNTFRα) 和 gp130 結(jié)合發(fā)揮作用，最終募集白血病抑制因子受體 β (LIFRβ) 并激活絲裂原活化蛋白激酶通路。

PDGF 一種有效的促有絲分裂因子 (有絲分裂原)，能調(diào)節(jié)結(jié)締組織和發(fā)育中神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞生長和分裂。甲狀腺激素 (T3) 和血小板衍生生長因子 (PDGF) 的組合通過 Wnt/β 促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化-連環(huán)蛋白信號通路。

SHH Hedgehog 家族分泌信號蛋白的一員，在成體干細(xì)胞增殖中起作用。SHH 是細(xì)胞增殖、神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元成熟的正向調(diào)節(jié)劑[17]。

IGF-I IGF-I 在大腦發(fā)育過程中表達(dá)，被認(rèn)為作用于所有神經(jīng)細(xì)胞。IGF-I 是調(diào)節(jié) NSCs 活化的關(guān)鍵。

FGF-8 誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞 (iNPCs) 衍生多巴胺能神經(jīng)元 (DA) 生成的關(guān)鍵因子。

GDNF 一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，能促進(jìn)中腦多巴胺能神經(jīng)元的存活分化，支持人多能干細(xì)胞來源的神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)元分化。

DAPI 用于染色細(xì)胞核。

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參考文獻(xiàn)

1. Yuewen Tang, L Cheng, et al. Current progress in the derivation and therapeutic application of neural stem cells. Cell Death Dis. 2017 Oct 12;8(10):e3108.
 
2. Yanjing Zhu, Ruiqi Huang, Liming Cheng, Rongrong Zhu, et al. Deep learning-based predictive identification of neural stem cell differentiation.Nat Commun. 2021 May 10;12(1):2614.
 
3. Roberta De Gioia, Stefania Corti, et al. Neural Stem Cell Transplantation for Neurodegenerative Diseases. Int J Mol Sci. 2020 Apr 28;21(9):3103.
 
4. Yuan Zhang, Xin-Yu Lu, Giacomo Casella, Jing Tian, Xing Li, et al. Generation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Bone Marrow Cells.Front Cell Neurosci. 2019 Jun 5;13:247.
 
5. Kyung-Chul Choi,Do-Sung Yoo, et al. Effect of Single Growth Factor and Growth Factor Combinations on Differentiation of Neural Stem Cells. J Korean Neurosurg Soc. 2008 Dec; 44(6): 375-381.
 
6. Hayashi Y, Tsai KJ, et al. Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer's disease models. J Biomed Sci. 2020 Jan 27;27(1):29.
 
7. Huang D, Wang Q, et al. A Nanoformulation-Mediated Multifunctional Stem Cell Therapy with Improved Beta-Amyloid Clearance and Neural Regeneration for Alzheimer's Disease. Adv Mater. 2021 Apr;33(13):e2006357.