質(zhì)譜分析具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快、分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)。隨著質(zhì)譜定量檢測(cè)技術(shù)的廣泛發(fā)展，穩(wěn)定同位素類化合物作為內(nèi)標(biāo)定量 (Stable Isotope-Labeled Internal Standard，簡(jiǎn)稱 SIL-IS) 目前已被公認(rèn)為是質(zhì)譜定量分析領(lǐng)域的極佳選擇。因?yàn)榉�(wěn)定同位素類化合物與被分析物具有幾乎完全相同的分子結(jié)構(gòu) (圖 1)、化學(xué)性質(zhì)、色譜和質(zhì)譜行為，可以有效地消除電離變化和基質(zhì)效應(yīng)^[1]，因而受到越來(lái)越多科研人員的推崇，廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)研究及生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品檢測(cè)等領(lǐng)域。

 

 

穩(wěn)定同位素作內(nèi)標(biāo)，可以減少基質(zhì)效應(yīng)、減少實(shí)驗(yàn)的人為誤差、提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度、同時(shí)檢測(cè)多個(gè)數(shù)據(jù)、提高實(shí)驗(yàn)效率，好處多多。那么穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)的關(guān)鍵量值指標(biāo)有哪些，該如何挑選穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)呢？干貨如下，拿走不謝~

 

 
 
 

1. 穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)的關(guān)鍵量值指標(biāo)

a. 同位素產(chǎn)品純度：一般 ≥ 98%。常指色譜純度，如 LCMS/MS，GCMS，HPLC 等，如果產(chǎn)品吸收或者 MS 較弱，也可以用 NMR 檢測(cè)等。

b. 同位素產(chǎn)品豐度 (Isotopic Enrichment)：一般 ≥ 98%。

c. 同位素產(chǎn)品有效期：同位素化合物內(nèi)標(biāo)均在有效期內(nèi)使用。
 

2. 如何挑選穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)

a. 除非實(shí)驗(yàn)特殊需求下，一般不選擇有活潑氘 (²H) 取代的同位素產(chǎn)品作內(nèi)標(biāo) (如氨基、羧基、羥基上的氫被氘取代)，這些活潑氘極易被交換為氫。

b. 同位素標(biāo)記的 ¹³C 和¹⁵N 化合物穩(wěn)定性較好，但是 ¹³C和¹⁵N 的價(jià)格相對(duì)較貴些。目前市場(chǎng)上含有氘 (²H) 的同位素產(chǎn)品因?yàn)閮r(jià)格相對(duì)便宜且數(shù)量相對(duì)較多，因此在滿足實(shí)驗(yàn)要求的情況下，也可選擇氘代物作為內(nèi)標(biāo)。

c. 選擇氘 (²H) 代化合物作為內(nèi)標(biāo)時(shí)，一般選擇比非同位素產(chǎn)品分子量多 3 及以上的產(chǎn)品 [即含有氘原子個(gè)數(shù)為 3 個(gè) (D3) 或者以上]。

   

在有機(jī)分析研究中，質(zhì)譜分析法比化學(xué)和光學(xué)分析法具有更加卓越的性能，而穩(wěn)定同位素作內(nèi)標(biāo)成為了質(zhì)譜定量的金標(biāo)準(zhǔn)，下面就隨著小 M 來(lái)看下穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)在質(zhì)譜定量分析中的實(shí)際應(yīng)用吧~

 
一、糖尿病人視網(wǎng)膜病變治療研究中的應(yīng)用

Candesartan 和 Irbesartan 已被證明能有效預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)斐傻膿p傷。為了開發(fā)新型治療此疾病的滴眼劑配方，Tan A 等人利用 Candesartan-d4 & Irbesartan-d4 穩(wěn)定同位素做內(nèi)標(biāo)，開發(fā)了一種新的 LC-MS/MS 方法，此方法可同時(shí)定量測(cè)定出兔眼組織中 Candesartan & Irbesartan 的含量，并對(duì)該方法的濃度范圍、準(zhǔn)確度及精密度、基質(zhì)效應(yīng)、樣品回收率等均做了驗(yàn)證。該方法也已成功應(yīng)用于家兔的體內(nèi)生物分布和藥代動(dòng)力學(xué)研究^[2]。

 

圖 2. Candesartan 和 Candesartan-d4, Irbesartan 和 Irbesartan-d4 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

 

圖 3. 穩(wěn)定同位素類化合物做內(nèi)標(biāo)實(shí)驗(yàn)流程圖

 

那么如何操作呢？實(shí)驗(yàn)的具體過(guò)程如下：

 
 
 
 

(1) Candesartan & Irbesartan 標(biāo)準(zhǔn)液及其同位素內(nèi)標(biāo)液制備

在乙腈/水 (80/20，V/V) 中配置 Candesartan & Irbesartan 的標(biāo)準(zhǔn)液和內(nèi)標(biāo)液，標(biāo)準(zhǔn)液分配成 200 和 500 μg/mL，內(nèi)標(biāo)液配置 500 μg/mL 備用，放置于 -20 ℃ 備用。
 

(2) 樣品前處理

稱量好的兔眼組織樣品在稀釋的兔血漿中以 1:19 的比例混合均勻，其勻漿上清液保存于 -80 ℃。取 200 μL 的兔組織勻漿上清液依次與 100 μL 內(nèi)標(biāo)液溶于甲醇/水 (20:80，V/V) 和水混合。然后將混合物裝載到預(yù)處理的 HLB 柱中洗脫。洗脫后的純品用 200 μL 甲醇/水/甲酸 (70:29.75:0.25，V/V/V) 復(fù)溶。
 

(3) LC-MS/MS 分析樣本

將 (2) 中稀釋好的的樣品 20 μL 注入 C18 柱進(jìn)行梯度分離，柱溫 25 ℃，流速 0.8 mL/min。Candesarta 和 Candesarta-d4 在 5.1 min 洗脫，Irbesartan 和  Irbesartan-d4 在 4.1 min 洗脫。MS 檢測(cè)采用正電噴霧電離 (ESI) 模式。
 

(4）數(shù)據(jù)分析

通過(guò)分析六批次 456 個(gè)兔組織樣本，用 Candesartan-d4 & Irbesartan-d4 做內(nèi)標(biāo)，準(zhǔn)確測(cè)定了兔組織樣本中在角膜、房水和玻璃體樣本中的精確含量，測(cè)定出 Candesartan 在角膜中含量為 1704.75 ng/g，在房水中的含量為 63.45 ng/g；Irbesartan 在角膜中的含量為 3546.30 ng/g，在玻璃體中的含量為 36.52 ng/g.
 

圖 4. Candesartan 在角膜和房水樣本中的

LC-MS/MS 色譜圖

 

通過(guò)分析六批次 456 個(gè)兔組織樣本，用 Candesartan-d4 & Irbesartan-d4 作內(nèi)標(biāo)，準(zhǔn)確測(cè)定了兔組織樣本中 (角膜、房水和玻璃體) 的精確含量，測(cè)定出 Candesartan 在角膜中含量為 1704.75 ng/g，在房水中的含量為 63.45 ng/g。
 
二、COVID-19 藥物治療研究中的應(yīng)用
全球 COVID-19 爆發(fā)以來(lái)，對(duì)此疾病的藥物治療研究備受科研工作者的重視。據(jù)報(bào)道，Ibuprofen 可以有效緩解與 COVID-19 相關(guān)的癥狀。Ibuprofen 的療效及其不良反應(yīng)與其在血液中的濃度密切相關(guān)，所以準(zhǔn)確定量測(cè)定 Ibuprofen 在血液中的濃度至關(guān)重要。

 

圖 5. Ibuprofen 和 Ibuprofen-d3 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

 

Changmao Wang 等人用穩(wěn)定的同位素標(biāo)記 Ibuprofen-d3 做內(nèi)標(biāo)簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確地定量測(cè)定人血漿中的 Ibuprofen 含量，該方法不但檢測(cè)時(shí)間短，且無(wú)基質(zhì)效應(yīng)及個(gè)體間差異性的影響，已成功應(yīng)用于 18 名健康中國(guó)志愿者口服 Ibuprofen 顆粒后的臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究，其結(jié)果證明了 Ibuprofen 可以改善 COVID-19 免疫反應(yīng)并縮短患者的康復(fù)時(shí)間^[3]。

 

圖 6. Ibuprofen 及 Ibuprofen-d3 在血脂、

溶血和人血漿中的基質(zhì)效應(yīng)表，

顯示 Ibuprofen-d3 作內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)無(wú)影響

 

跟著 M 君已經(jīng)了解了這些穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)在質(zhì)譜定量分析中的應(yīng)用，您目前是否也想嘗試下穩(wěn)定同位素產(chǎn)品在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用呢？下面就讓 M 君帶您瀏覽下 MCE 穩(wěn)定同位素類產(chǎn)品吧！

 

相關(guān)產(chǎn)品

Exatecan-d5 (mesylate) 是Exatecan mesylate 的氘代物。Exatecan Mesylate 是一種 DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶 I (topoisomerase I) 抑制劑。

Candesartan-d4 是 Candesartan 的氘代物，Candesartan 是血管緊張素 II 受體拮抗劑。

Irbesartan-d4 是 Irbesartan 的氘代物，Irbesartan 是 Ang II 型 1 (AT1) 受體拮抗劑。

(±)-Levomepromazine-d6 是 Methotrimeprazine 的氘代物，Methotrimeprazine 在多個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)受體部位具有拮抗作用，包括多巴胺能、膽堿能、血清素和組胺受體。

Sofosbuvir-d6 是 Sofosbuvir (PSI-7977) 的氘代物，Sofosbuvir 是 HCV RNA 復(fù)制抑制劑。

Ercalcidiol-d3 是 Ercalcidiol 的氘代物。Ercalcidiol 是維生素 D2 的代謝產(chǎn)物。Ercalcidiol 可用作維生素 D 狀態(tài)的指標(biāo)。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)
 

參考文獻(xiàn)

1. Ulvik A, Ueland PM, et al. Quantifying Precision Loss in Targeted Metabolomics Based on Mass Spectrometry and Nonmatching Internal Standards. Anal Chem. 2021 Jun 1; 93 (21):7616-7624.
 
2. Tan A, Fanaras JC, et al. Simultaneous quantification of candesartan and irbesartan in rabbit eye tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 2020 May; 34 (5): e4808.
 
 
3. Wang C, Jia Y, et al. Establishment and validation of an SIL-IS LC-MS/MS method for the determination of ibuprofen in human plasma and its pharmacokinetic study. Biomed Chromatogr. 2022 Mar; 36 (3): e5287.