花青染料（cyanine）作為構(gòu)建熒光探針的重要核心，還具有一定的光療潛力。此外，cyanine與其他治療劑偶聯(lián)（共價結(jié)合），不僅可以提高治療效果，而且拓寬了對于治療模式的選擇。我們此前曾分享過北京大學戴志飛教授團隊關(guān)于cyanine用于生物醫(yī)學影像探針研究的綜述性文章（詳情請見 花青偶聯(lián)物用于生物醫(yī)學影像探針的研究 ）。在此基礎上，戴教授團隊進一步關(guān)注了cyanine-治療劑偶聯(lián)物在癌癥治療診斷學中運用的進展，并進行了詳細的分類與整理，希望此次的分享能夠為相關(guān)領域科研工作者們的研究提供助益。

• 癌癥治療診斷學的概念

異質(zhì)性、轉(zhuǎn)移性和治療抵抗等因素的共同作用，使癌癥成為世界范圍內(nèi)導致死亡的一種主要疾病。為應對這些挑戰(zhàn)，研究人員逐步開發(fā)出一種將“診斷成像”與“治療干預”相結(jié)合的新型模式，稱為癌癥治療診斷學，要求治療診斷試劑應當作為一個獨立的集成系統(tǒng)，同時具備治療和診斷能力。這樣的系統(tǒng)通常由治療劑和造影劑組成，有時還會進一步添加用以增強腫瘤靶向效果的“彈頭”。除具備基本的治療效果外，該系統(tǒng)還可以從復雜的生物系統(tǒng)中提取實時診斷信息，因此具有令人期待的應用前景。

cyanine是聚甲炔染料家族的一個子類，與其他熒光染料相比，具有高摩爾吸收率、窄吸收/發(fā)射帶、紫外/可見光（UV/Vis）及近紅外（NIR）范圍的光譜分布，優(yōu)良的生物相容性和低毒性等優(yōu)點。具備光轉(zhuǎn)換能力的cyanine本身可作為光療劑用于研究。而與其他強效治療劑偶聯(lián)，則可進一步提高藥物的治療效果，拓寬治療模式。當需要在生命系統(tǒng)中發(fā)揮作用、特別是需要進行體內(nèi)表征時，最好選擇NIR生物窗范圍（> 650 nm）發(fā)射的cyanine用于偶聯(lián)，因為該波段的熒光信號具有深層組織穿透性、光毒性較小、光散射減少以及自發(fā)熒光最小等固有優(yōu)勢。

在cyanine-治療劑偶聯(lián)物中，cyanine主要作為診斷工具來發(fā)揮作用。根據(jù)偶聯(lián)物的治療模式，可將其分為化療、光療和靶向治療等類型，此外還包括可用于遞送治療劑的cyanine納米載體等，分述如下。

化療是一種利用抗癌藥物（化療藥物）治療癌癥的傳統(tǒng)方法�？拱┧幬锏目鼓[瘤作用源于對快速分裂細胞的毒性，因為腫瘤通常以不受控制的增殖為特征。由于無法區(qū)分其他快速分裂細胞（非選擇性），化療可引起惡心、嘔吐、骨髓抑制、脫發(fā)等諸多不良反應。為避免這些缺陷，將抗癌藥物與具有腫瘤親和性的七甲炔cyanine偶聯(lián)、用于腫瘤靶向遞送是一種合理的解決辦法。在治療過程中，cyanine-化療劑偶聯(lián)物還可以提供評估化療狀態(tài)的信息。

目前，已報道的可用于cyanine偶聯(lián)物配方的化療藥物有：抗代謝藥（如，甲氨蝶呤、吉西他濱），烷化劑（如，氮芥、順鉑、替莫唑胺），拓撲異構(gòu)酶抑制劑（如，喜樹堿），有絲分裂抑制劑（如，紫杉醇）等。其結(jié)合過程通常會利用藥物分子上的先天反應基團來促進生物相容性酯或酰胺鍵的形成。

此外，通過在腫瘤部位給與內(nèi)部或外部刺激，選擇性激活前體藥物的策略，可以達到降低脫靶毒性和提高化療效果的目的。內(nèi)部刺激，包括腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境中固有的條件，如低pH、缺氧、ROS、過度表達的酶等；外部刺激，包括人為施加的光照、溫度等條件。

以前體藥物策略設計cyanine-化療劑偶聯(lián)物，可將其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂?ldquo;應激性”的治療診斷劑（在正常組織中保持無活性，在腫瘤部位被激活并分解釋放藥物），如此一來，不僅可以起到可控的化療效果，還可以監(jiān)測藥物的生物分布和活化情況。

cyanine染料在偶聯(lián)和非偶聯(lián)狀態(tài)下會表現(xiàn)出不同的光譜特征，更加支持了利用前體藥物進行激活/監(jiān)測的機制。例如，GSH水平在各種癌癥中升高的特點，經(jīng)常被用作前體藥物設計中的內(nèi)部刺激因素，可以此來設計能夠被GSH切割的二硫鍵接頭結(jié)構(gòu)：如，將IR780通過含二硫鍵的接頭與甲氨蝶呤偶聯(lián)，在GSH促進裂解后，cyanine和甲氨蝶呤之間的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移被破壞，導致654 nm處的初始峰消失，在802 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，而750nm處的熒光峰也會轉(zhuǎn)移到808 nm處。因此可對其同時進行生物分布（λex = 640 nm ）和生物活化（λex = 745 nm ）的監(jiān)測。對其他指標的分析表明，與單獨的甲氨蝶呤相比，該前體藥物具有更加優(yōu)異的腫瘤靶向能力和更好的抗腫瘤效果。

圖1. 靜脈注射偶聯(lián)藥物后，在指定時間點、通過生物分布(640 nm)和活化(745 nm)通道分別監(jiān)測MCF-7異種移植小鼠模型的體內(nèi)NIRF成像（左）以及正常器官和腫瘤的離體NIRF成像（右）結(jié)果。

另一方面，在一些設計中，利用光照可以使藥物從cyanine偶聯(lián)物中釋放，有利于對前體藥物的激活進行控制。NIR光因其深層組織穿透力和最小的光細胞毒性而尤其適合應用此策略。例如，一種基于光裂解cyanine支架進行藥物釋放的籠狀喜樹堿前體藥物，其聚甲炔鏈發(fā)生光氧化裂解，誘導籠狀鏈發(fā)生自我消解并最終釋放藥物。通過820 nm發(fā)射光通道可追蹤前體藥物的生物分布；而在680 nm光照下，前體藥物發(fā)生分解，產(chǎn)生535 nm的新發(fā)射峰，可用于評估藥物的活化狀態(tài)。

圖1. 靜脈注射偶聯(lián)藥物后，在指定時間點、通過生物分布(640 nm)和活化(745 nm)通道分別監(jiān)測MCF-7異種移植小鼠模型的體內(nèi)NIRF成像（左）以及正常器官和腫瘤的離體NIRF成像（右）結(jié)果。

另一方面，在一些設計中，利用光照可以使藥物從cyanine偶聯(lián)物中釋放，有利于對前體藥物的激活進行控制。NIR光因其深層組織穿透力和最小的光細胞毒性而尤其適合應用此策略。例如，一種基于光裂解cyanine支架進行藥物釋放的籠狀喜樹堿前體藥物，其聚甲炔鏈發(fā)生光氧化裂解，誘導籠狀鏈發(fā)生自我消解并最終釋放藥物。通過820 nm發(fā)射光通道可追蹤前體藥物的生物分布；而在680 nm光照下，前體藥物發(fā)生分解，產(chǎn)生535 nm的新發(fā)射峰，可用于評估藥物的活化狀態(tài)。

圖3. 將IR-808與PEG/BPEI雙功能化的NGO結(jié)合得到偶聯(lián)物，右圖顯示其在腫瘤靶向成像和協(xié)同光療中的效用。

靶向治療：cyanine作為偶聯(lián)接頭

分子生物學和泛組學分析（如基因組學、蛋白質(zhì)組學）的進步，有助于識別癌細胞中各種異�；蜻^度表達的分子靶標。針對這些靶標進行藥物設計，可以特異性地阻斷腫瘤進展并減少不良反應，這構(gòu)成了靶向治療的概念。

目前已有許多腫瘤相關(guān)靶點得到驗證并用于藥物研發(fā)。對于這些靶點，有兩種主要類型的靶向治療物可用于cyanine偶聯(lián)，包括單克隆抗體（mAb）和小分子抑制劑。其中，cyanine-mAbs偶聯(lián)物在相關(guān)報道中主要作為熒光探針用于靶向分子成像。另一方面，將源自mAb的抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）與cyanine結(jié)合成為治療診斷劑，正逐漸成為新的研究亮點。

在ADC中，抗體作為靶向彈頭，用于準確地遞送化療藥物。通常，偶聯(lián)結(jié)構(gòu)中的接頭對于ADC的性能有著至關(guān)重要的作用，需要具備兩個基本特性：①在體循環(huán)中保持穩(wěn)定，以避免脫靶藥物釋放；②在ADC內(nèi)化時快速切割以釋放藥物。將cyanine骨架作為ADC結(jié)構(gòu)中的接頭是一種開創(chuàng)性的設計思路，可以通過NIR光觸發(fā)的光氧化裂解實現(xiàn)對于藥物的按需釋放。


圖4. NIR光觸發(fā)藥物從ADC中釋放的機制，其中七甲炔cyanine作為接頭。將A431腫瘤植入小鼠背部兩側(cè)，注射偶聯(lián)藥物兩天后，僅對左側(cè)腫瘤進行不同劑量的690 nm光照射，活體NIRF成像結(jié)果如圖所示。
另一方面，小分子抑制劑通常會中斷細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導，這種抑制作用主要是由于其占據(jù)了目標蛋白的功能域。大多數(shù)小分子抑制劑靶向蛋白激酶，如達沙替尼就是一種臨床可用的酪氨酸激酶抑制劑（TKI），可用于治療慢性粒細胞白血病和急性淋巴細胞白血病。利用達沙替尼構(gòu)建的cyanine偶聯(lián)物，可以增強藥物向腫瘤靶向遞送的效果。

cyanine偶聯(lián)物作為納米載體

與上述直接和治療劑結(jié)合的情況相比，cyanine還可以被選擇性地制成納米載體偶聯(lián)物，用于傳遞治療劑，包括化療劑、基因等。根據(jù)納米載體的結(jié)構(gòu)和組成，可以通過靜電/疏水相互作用、共價或非共價的方式來固定或封裝藥物。這些納米治療劑具有顯著的腫瘤選擇性，包括被動靶向、通過配體介導的相互作用進行主動靶向，以及通過內(nèi)在或外在刺激觸發(fā)藥物釋放。

多樣化的納米載體平臺，也為cyanine的偶聯(lián)提供了巨大的可能性，例如，將cyanine染料與親水聚合物分子偶聯(lián)，在水溶液中可自組裝為雙層納米粒子結(jié)構(gòu)，可有效地裝載甲氨蝶呤（包封率＞40%），并表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。

在腫瘤靶向基因遞送方面，有研究團隊構(gòu)建了一種IR783-b2kPEI偶聯(lián)物作為熒光納米載體，其中聚陽離子PEI支架負責與帶負電荷的核酸產(chǎn)生互作。該載體顯示出良好的向核胞內(nèi)轉(zhuǎn)運特性，并被認定為是一種有效的腫瘤靶向轉(zhuǎn)染劑，可在小鼠異種移植模型中同時檢測NIRF信號以及通過熒光素酶監(jiān)測基因表達。

圖5. IR783-b2kPEI偶聯(lián)物與表達熒光素酶的pGL3質(zhì)粒復合，用于轉(zhuǎn)染G361腫瘤異種移植小鼠；尾靜脈注射該復合物后24 h，對解剖腫瘤進行NIRF成像（上圖）和生物發(fā)光成像（下圖）。

技術(shù)展望
      通過戴教授及其團隊成員的辛勤工作，我們可以較為清晰地了解到目前已有的、可參與癌癥治療診斷系統(tǒng)偶聯(lián)設計的治療劑及其相應的偶聯(lián)策略，在此表示誠摯的感謝！
      在利用熒光成像技術(shù)進行癌癥治療診斷系統(tǒng)研發(fā)的過程中，熒光信號的有限穿透深度降低了大多數(shù)cyanine偶聯(lián)物的診斷價值。此外，cyanine的光穩(wěn)定性較差，無法進行長時間實時監(jiān)測等阻礙，使其更適合在連續(xù)時間點內(nèi)進行成像。另一方面，對于傳統(tǒng)的平面熒光成像結(jié)果，其有效性會受到z軸信息不足的影響。因此，研究人員還需要利用更加先進的成像技術(shù)來解決上述問題。
       對此，戴教授著重提到了一種新型的“臨床前多模態(tài)活體成像平臺FLECT/CT”，將其作為優(yōu)秀的下一代成像解決方案予以介紹：該成像平臺可以在單次采集的過程中，同步收集活體小鼠的CT和熒光數(shù)據(jù)，以進行全角度的3D斷層成像，使研究人員可以最大限度地利用從成像結(jié)果中獲取的信息。





圖6. FLECT/CT系統(tǒng)利用激光激發(fā)已進行NIR標記的樣品，以探測器環(huán)環(huán)繞的方式在樣品周圍收集發(fā)射光信號。隨著機體位置的不斷改變，完成從單層采集到3D采集再到重建與可視化分析的全方位掃描過程。同軸一體的CT模塊為光學信號提供精確的解剖學參考。

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