Micro-CT技術(shù)在臨床前動物實驗研究中的應用案例
小動物活體CT影像技術(shù)（Micro-CT），又稱微型計算機斷層掃描或顯微CT，是一種利用微焦點X射線或微型X射線管、對離體或活體實驗動物進行局部或整體快速掃描，從而能夠在不損傷樣本結(jié)構(gòu)或活體動物的情況下、以低輻射劑量獲得微米量級高分辨率精細圖像的3D成像技術(shù)。利用Micro-CT還可以對樣品進行定量分析，所涉及的應用領域包括：心血管、肺部疾病、代謝、腫瘤檢測、骨疾病等研究。此外，Micro-CT還可以與三維光學成像結(jié)合成為多模態(tài)影像系統(tǒng)，便于用戶在單次實驗過程中獲取更多的成像信息。
由于在臨床前動物實驗研究中具有廣泛的應用性，我們根據(jù)已有的用戶案例，針對性地選取了Micro-CT技術(shù)在癌癥生物學、轉(zhuǎn)移性腫瘤評估和神經(jīng)外傷三個方面的應用進行分享，以期能夠促進相關領域的交流和學習。
（1）癌癥生物學
為實現(xiàn)開發(fā)新型療法的目標，癌癥生物學的研究對于進一步了解癌癥進展的生物學機制和途徑非常重要。在癌癥生物學的研究中，表皮生長因子受體（EGFR）是一種已經(jīng)過充分研究的受體，在85-90%的非小細胞肺癌（NSCLC）中都發(fā)現(xiàn)了導致EGFR過度表達的基因突變。因此，對EGFR通路的研究對于NSCLC的治療具有重要意義，特別是其與其他蛋白質(zhì)的相互作用。SQSTM1是一種自噬性的貨物蛋白，可結(jié)合并去除不必要的或功能失調(diào)的蛋白質(zhì)，在細胞調(diào)節(jié)和存活中發(fā)揮重要作用。當與EGFR等特定蛋白質(zhì)相互作用時，SQSTM1的正常功能會受到抑制，導致腫瘤發(fā)生。中國醫(yī)科院免疫學和癌癥藥理學研究組重點探究了SQSTM1-EGFR蛋白互作及其在NSCLC進展中的作用。研究人員對干擾EGFR-SQSTM1相互作用的肽SAH-EJ2是否會抑制NSCLC的進展進行了評估，首先使用標準生化技術(shù)在體外條件下評估SAH-EJ2對EGFR-SQSTM1的作用，然后利用NSCLC動物模型進行成像實驗，以評估在活體條件下的2個月治療期內(nèi)SAH-EJ2的治療效果。
圖1：評估SAH-EJ2對于NSCLC的治療效果
首先建立經(jīng)誘導后會形成肺腺癌的轉(zhuǎn)基因動物模型，并確定其腫瘤的形成；然后使用InSyTe FLECT/CT系統(tǒng)中的CT模塊評估腫瘤對于治療肽SAH-EJ2及對照肽SAH-Con的反應——以每周2次以上的頻率對腫瘤模型小鼠施用SAH-EJ2、SAH-Con，持續(xù)2個月，定期進行CT成像，追蹤腫瘤的進展（圖中箭頭顯示腫瘤形成部位，表明施用肽SAH-EJ2可減少肺腺癌的發(fā)生）；最后在處死后對切除的腫瘤進行生化分析。（2）轉(zhuǎn)移性腫瘤評估
新的診斷和治療標志物的鑒定對于肺癌的早期檢測和成功治療具有重要意義。HNRNPK是一種RNA和DNA結(jié)合蛋白，在細胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用。它是已知的p53腫瘤抑制蛋白的共激活劑，還可以調(diào)節(jié)DNA損傷修復。目前已在肺癌中發(fā)現(xiàn)了HNRNPK的過度表達現(xiàn)象，并且與預后不良有關。為研究HNRNPK與肺癌的關系，中國醫(yī)科院實驗動物研究所的研究人員開發(fā)出了一種HNRNPK表達下調(diào)的人肺癌細胞系A549。利用該種細胞系，進一步開發(fā)出肺癌動物模型，用于研究HNRNPK下調(diào)對腫瘤發(fā)展的影響——在細胞注射后用多西環(huán)素（doxycycline）處理1周誘導HNRNPK下調(diào)，并利用CT成像在體內(nèi)評估轉(zhuǎn)移性腫瘤的發(fā)展。
圖2：評估HNRNPK下調(diào)對轉(zhuǎn)移性腫瘤發(fā)展的影響
使用InSyTe FLECT/CT系統(tǒng)中的CT模塊，對經(jīng)doxycycline誘導的HNRNPK下調(diào)肺癌細胞（sh-HNRNPK）和對照組肺癌細胞（sh-NC）形成的轉(zhuǎn)移性肺腫瘤進行可視化觀察。獲得的CT圖像顯示，相較于HNRNPK下調(diào)的實驗組，對照組中存在更多的腫瘤轉(zhuǎn)移——箭頭指向單個轉(zhuǎn)移部位，表明HNRNPK下調(diào)的腫瘤會發(fā)生較少轉(zhuǎn)移，說明HNRNPK對于調(diào)節(jié)腫瘤的轉(zhuǎn)移和進展具有作用，可作為潛在的治療靶點進行深入研究。
（3）神經(jīng)外傷
對神經(jīng)炎癥的研究通常使用一種被稱為失重創(chuàng)傷性腦損傷模型的方法。已知該模型會誘導顱骨骨折，隨后受傷部位會表達細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶或激活其他基因。失重創(chuàng)傷性模型的多變性將導致這些基因呈現(xiàn)不同的表達水平，并會改變受傷后骨骼重塑的持續(xù)時間。此外，由于骨骼結(jié)構(gòu)的厚度以及恢復時創(chuàng)傷性腦損傷的嚴重程度不同，小鼠的年齡也會對是否會發(fā)生骨折產(chǎn)生影響。拉脫維亞有機合成研究所的研究團隊使用高分辨率的Micro-CT技術(shù)，對撞擊部位的顱骨厚度進行量化分析。利用獲得的3D斷層掃描數(shù)據(jù)，可以可視化地觀察顱骨骨折，并利用橫截面視圖來評估受傷部位的骨厚度。
圖3：評估失重創(chuàng)傷性模型建立后的相關信息
利用InSyTe FLECT/CT系統(tǒng)上的CT模塊，研究人員確定了撞擊區(qū)域的位置，并對撞擊位置的顱骨厚度和骨密度進行評估（圖中顯示了受頂骨撞擊部位影響的冠狀截面上的厚度和密度測量點）。對測量值進行統(tǒng)計分析，可以確定撞擊后出現(xiàn)或未出現(xiàn)頭骨骨折的實驗動物個體的平均值和標準誤差。這項分析使研究人員能夠證實他們的假設，即顱骨骨折的創(chuàng)傷性腦損傷會導致更嚴重的神經(jīng)行為反應和腦組織中炎癥基因的顯著表達。
技術(shù)亮點：InSyTe FLECT/CT系統(tǒng)所配備的Micro-CT模塊具有卓越的軟組織和骨成像能力，使得研究人員能夠以非侵入、可視化的方式，觀察和追蹤腫瘤對于治療藥物的反應、肺部腫瘤的轉(zhuǎn)移情況以及顱骨損傷的影響區(qū)域，而無需再使用造影劑，有效縮減了操作流程和實驗成本。
參考文獻：
1. Disruption of the EGFR-SQSTM1 interaction by a stapled peptide suppresses lung cancer via activating autophagy and inhibiting EGFR signaling. Cancer Letters, Vol. 474, pp 23-35, 2020. DOI: 10.1016/j.canlet.2020.01.004
2. Downregulation of HNRNPK in human cancer cells inhibits lung metastasis. Animal Model and Experimental Medicine, Vol. 2, pp 291-296, 2019. DOI: 10.1002/ame2.12090
3. Skull fractures induce neuroinflammation and worsen outcome after closed head injury in mice. Journal of Neurotrauma, Vol. 37, pp 295-304, 2020. DOI: 10.1089/neu.2019.6524
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