目前，患有急性白血病或骨髓增生異常等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的患者，在經(jīng)過同種異體造血干細胞移植（HSCT）治療后，仍然面臨復發(fā)的可能，復發(fā)是導致治療失敗的主要原因之一。細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK），在體外和體內(nèi)動物模型中均顯示出有效的抗白血病細胞毒性，因此，CIK細胞的應(yīng)用，可作為一種有前景的免疫治療方法，用于對抗復發(fā)。

考慮到復發(fā)患者迫切的治療需求，德國法蘭克福大學的一支研究團隊開發(fā)出了一種高效的培養(yǎng)工藝，可以利用供體來源的外周血（PB）或白細胞去除術(shù)（LP）產(chǎn)品生成不同臨床劑量的即用型CIK細胞，解決了與細胞培養(yǎng)相關(guān)的血清供應(yīng)瓶頸的問題，有效地節(jié)省了時間、人力和成本消耗，且符合良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）。

CIK細胞的生成

常規(guī)的CIK細胞培養(yǎng)需要3周的時間�？紤]到患者治療時間的緊迫性，研究人員專注于在更短的時間內(nèi)生成高效的CIK細胞產(chǎn)品。

通過在培養(yǎng)的第4和第8天添加IL-15，可以使原始材料中具有CIK細胞表型的細胞在10-12天內(nèi)擴增。與對照組相比，IL-15激活的CIK細胞的體外細胞毒性顯著增強，并且在幾種已建立的人類白血病異種移植小鼠模型中具有廣泛的體內(nèi)抗白血病功效，使受體存活率提高。采用此種方法，可以建立一個高效的、符合GMP規(guī)范的CIK細胞生產(chǎn)工藝，用于提供不同臨床劑量規(guī)格的細胞產(chǎn)品：1 × 10^6，5 × 10^6，1 × 10^7，1 × 10^8 T細胞/kG受體體重，滿足不同患者的需要。

開發(fā)替代血清的培養(yǎng)方法
CIK細胞的常規(guī)培養(yǎng)需要添加血清，由于臨床條件下的生產(chǎn)經(jīng)常會面臨AB血清短缺的瓶頸，研究人員致力于尋找可作為AB血清替代品的培養(yǎng)基補充劑。
通過分別測試添加AB血清、新鮮冷凍血漿（FFP）、血小板裂解物（PL）的培養(yǎng)效果，發(fā)現(xiàn)與沒有補充劑的對照組相比，AB血清、FFP和PL的存在均可顯著提高細胞的擴增速率（10倍），但在這3這種補充劑之間未觀察到顯著差異。
進一步的檢測結(jié)果顯示，與AB血清相比，用FFP和PL培養(yǎng)的CIK細胞顯示出相同的活力、表型（CIK細胞由CD3+CD56陽性的T細胞、T-NK細胞和少數(shù)NK細胞組成）以及針對白血病靶細胞系THP-1的細胞毒性。

注：考慮到FFP更容易獲得，研究人員已決定采用FFP作為CIK細胞擴增培養(yǎng)的補充劑，并在此基礎(chǔ)上對之前的生產(chǎn)許可文件（ATMP § 4b Abs, 3 AMG，許可證號：PEI.A.11630.01.1）進行了相應(yīng)修改。
CIK細胞的冷凍保存與活力恢復
按照預(yù)定的給藥劑量，對生成的CIK細胞進行冷凍保存，可以最大限度地減少細胞供應(yīng)的時間和成本。由于此前的報道缺乏關(guān)于冷凍保存和解凍后CIK細胞的活力、細胞毒性等信息。研究人員補充分析了CIK細胞在經(jīng)過過夜凍存和長期凍存（2年）后的細胞毒性潛力，結(jié)果令人鼓舞：

經(jīng)冷凍保存的CIK細胞仍然具有很高的穩(wěn)定性和活力：凍存前的存活率為95.9%，過夜凍存后的存活率為92.8%，長期（2年）凍存后的存活率為89.3%。
注：使用可控速率的BIOFREEZE BV45程序降溫儀（Consarctic），可將CIK細胞穩(wěn)定而安全地保存于冷凍袋中，在液氮中儲存過夜。

 

注：通過臺盼藍染色，對2016以來的42個解凍樣本進行分析（此項分析內(nèi)容屬于產(chǎn)品發(fā)布之前QC的一個重要組成部分），在所有情況下，被測樣本均滿足>70%存活率的要求。基于這些結(jié)果，CIK細胞的冷凍保存方法已獲得當局（Paul-Ehrlich-Institute）批準。

同時，經(jīng)冷凍保存后的CIK細胞的恢復能力、表型、細胞毒性，均與新鮮制備的CIK細胞無顯著差異。
技技術(shù)亮點：

CIK細胞在補充FFP的培養(yǎng)條件下可以保留增殖、活力、表型和功能等主要特征，這些特征在冷凍保存后依然不受影響。研究人員據(jù)此成功建立了符合GMP的CIK細胞生產(chǎn)工藝，能夠有效減少生產(chǎn)不同治療劑量的CIK細胞所需的時間、人力及成本投入。

由于整個生產(chǎn)工藝對質(zhì)控有著非常高的要求，最終的細胞治療效果取決于很多環(huán)節(jié)，其中涉及的與樣本相關(guān)的凍存、溶解以及在液氮中的長期儲存，對于后續(xù)細胞治療的效果尤其重要。對于凍存，研究人員選擇了Consarctic品牌的BIOFREEZE BV45程序降溫儀，使用液氮制冷，低溫存儲溫度可低至-196℃，提供針對不同細胞的冷凍程序，尤其適合于活細胞樣品的保存。

參考文獻：
Improving Clinical Manufacturing ofIL-15 Activated Cytokine-InducedKiller (CIK) Cells, Front Immunol. 2019 May 31;10:1218. DOI: 10.3389/fimmu.2019.01218. 

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