WB/ELISA/IHC/FC實(shí)驗指南：如何選擇合適的對照劑和封閉劑？
你是否遇到過以下幾種難題，IHC實(shí)驗結(jié)果不準(zhǔn)確，背景高；多標(biāo)記免疫組化實(shí)驗中一抗種屬來源相同時，不知該如何進(jìn)行實(shí)驗；IP/Co-IP后的WB實(shí)驗出現(xiàn)非特異性條帶；流式實(shí)驗中沒有合適的直標(biāo)一抗......你是否知道通過選擇正確的對照劑和封閉劑，可以幫助你解決這些實(shí)驗中遇到的難題，且更容易獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗結(jié)果。本文將給大家?guī)砹魇郊?xì)胞實(shí)驗、WB、ELISA、IHC幾大實(shí)驗中常見的問題，及解決辦法。
流式細(xì)胞實(shí)驗（Flow Cytometry）
| 可能遇到的問題 | 解決辦法 | 適用試劑 |
| 因抗體與樣本中的Fc受體相結(jié)合而產(chǎn)生不需要的背景 | 對Fc受體進(jìn)行封閉 | 標(biāo)準(zhǔn)封閉血清（血清應(yīng)與標(biāo)記的抗體種屬來源一致） |
| 使用F（ab'）2形式的二抗來防止二抗與Fc受體的結(jié)合 | F（ab'）2形式的二抗 | |
| 如何確認(rèn)一抗與抗原是特異性結(jié)合 | 使用同型對照抗體*作為陰性對照，用于顯示一抗有進(jìn)行特異性結(jié)合 *同型對照抗體指的是一種和一抗來源相同的沒有特異性的IgG蛋白 |
ChromPure™ 純化蛋白 |
| 如何確認(rèn)二抗產(chǎn)生的是目的信號 | 使用同型對照抗體*作為陰性對照，用于顯示二抗有進(jìn)行特異性結(jié)合 *同型對照抗體指的是一種和一抗來源相同的沒有特異性的IgG蛋白 |
ChromPure™ 純化蛋白 |
| 在沒有直標(biāo)一抗的條件下想要加快實(shí)驗進(jìn)度 | 在孵育樣本之前使用Fab片段抗體先與一抗孵育 | FabuLight™ Fab片段抗體 |
Western Blotting實(shí)驗
| 可能遇到的問題 | 解決辦法 | 適用試劑 |
| 出現(xiàn)非特異性條帶 | 在用一抗孵育前，使用適當(dāng)?shù)淖钄嘣噭┳钄嗄?/td> | 標(biāo)準(zhǔn)血清（5%v/v）（血清應(yīng)與標(biāo)記的抗體種屬來源一致），或BSA（5%w/v）（不含IgG蛋白和蛋白酶） |
| 如果使用來自山羊、馬或綿羊的一級抗體，則避免使用牛奶或牛血清白蛋白。牛的IgG可能與抗體相互作用，這是由于近緣種的同源表位。 | 標(biāo)準(zhǔn)血清（5%v/v）（血清應(yīng)與標(biāo)記的抗體種屬來源一致） | |
| IP后WB實(shí)驗時，目標(biāo)蛋白分子量位于25kDa或25kDa附近時，想要消除來自IP實(shí)驗的抗體干擾 | 為了避免檢測到50 kDa的抗體重鏈，使用抗輕鏈特異性的二抗。 | 抗輕鏈特異性的二抗 |
| 為了避免檢測到25 kDa的抗體輕鏈，使用單價Fab片段進(jìn)行阻斷后，使用抗IgG且抗Fc端特異性的二抗。 | 抗Fc端特異性的二抗+Fab片段二抗（FabuLight™） |
ELISA實(shí)驗
| 可能遇到的問題 | 解決辦法 | 適用試劑 |
| 高背景 | 在與一抗孵育之前，使用適量封閉試劑進(jìn)行完全封閉 | 標(biāo)準(zhǔn)血清（5%v/v）（血清應(yīng)與標(biāo)記的抗體種屬來源一致），或BSA（5%w/v）（不含IgG蛋白和蛋白酶） |
| 無信號 | 使用陽性對照證明帶標(biāo)記二抗的活性，并在孵育了一抗同型對照后直接用二抗來檢測 | ChromPure™純化蛋白 |
關(guān)于使用牛血清白蛋白(BSA)和牛奶作為封閉劑的Tips：
BSA和dry milk有時含有牛的IgG。除了Jackson提供的牛來源抗山羊IgG的二抗外，許多其他的如抗牛、抗山羊和抗綿羊的二抗都會與牛的IgG發(fā)生反應(yīng)。因此，使用BSA或dry milk進(jìn)行阻斷或稀釋會顯著增加背景并降低抗體效價。使用與二抗種屬來源一致的標(biāo)準(zhǔn)血清(5% v/v)來進(jìn)行阻斷是更好的選擇。
免疫組化實(shí)驗
| 可能遇到的問題 | 解決辦法 | 適用試劑 |
| 如何確認(rèn)一抗與抗原是特異性結(jié)合 | 使用同型陰性對照(與一抗物種相同的非特異性IgG)來證明一抗與抗原的特異性結(jié)合 | ChromPure™純化蛋白 |
| 高背景（General） | 將可能會與其他試劑結(jié)合的內(nèi)源性結(jié)合位點(diǎn)都封閉起來 | 標(biāo)準(zhǔn)血清（血清應(yīng)與標(biāo)記的抗體種屬來源一致） |
| 在沒有載體蛋白的緩沖液中稀釋抗體，并將該混合液離心以剝離沉淀物 | 如PBS/Tween 20等緩沖液 | |
| 因識別同源性免疫球蛋白而產(chǎn)生高背景 | 使用經(jīng)過預(yù)吸附處理的二抗來減少細(xì)胞或組織樣本中相關(guān)物種之間的交叉反應(yīng) | 經(jīng)過預(yù)吸附，最大程度消除物種間交叉反應(yīng)的二抗 |
| 封閉內(nèi)源性免疫球蛋白 | Fab片段二抗 | |
| 多標(biāo)免疫組化實(shí)驗時一抗種屬來源相同 | 根據(jù)protocol使用Fab片段二抗來完成多標(biāo)實(shí)驗 | Fab片段二抗 |
| 在孵育前先對一抗進(jìn)行免疫標(biāo)記 | FabuLight™ | |
| 內(nèi)源性酶 | 使用過氧化物封閉內(nèi)源性過氧化酶 | 過氧化物 |
| 使用levamisole封閉內(nèi)源性磷酸酶 | levamisole | |
| 內(nèi)源性生物素 | 封閉內(nèi)源性生物素 | 使用streptavidin（鏈霉親和素）孵育，以消除內(nèi)源性生物素 |
| 離子作用或疏水作用 | 在緩沖液中加入合適的試劑，優(yōu)化鹽濃度和pH值 | Tween 20 或/和Triton X-100 |
免疫試劑
上文中提到的能夠幫助解決實(shí)驗里出現(xiàn)的問題的免疫試劑介紹如下：
· 標(biāo)準(zhǔn)血清（Normal Serums）
標(biāo)準(zhǔn)血清來自未產(chǎn)生免疫反應(yīng)的動物，因此不會檢測到任何特異性抗原。在PBS(或類似的緩沖液)中稀釋到5% (v/v)的標(biāo)準(zhǔn)血清被強(qiáng)烈推薦作為阻斷劑，以減少非特異性、保守序列和/或fc受體結(jié)合的背景。最好的結(jié)果是使用稀釋的來自同一宿主的正常血清作為標(biāo)記抗體，在加入一抗之前作為單獨(dú)的孵育步驟。
相關(guān)產(chǎn)品推薦：
| 產(chǎn)品 | 貨號 | 規(guī)格 |
| 胎牛血清(標(biāo)準(zhǔn)級) | abs974 | 25ml/125ml/500ml |
| 馬血清（標(biāo)準(zhǔn)級） | abs990 | 125ml/500ml |
| 驢血清 | abs935 | 50ml |
· 從標(biāo)準(zhǔn)血清中提取的ChromPure™純化蛋白（ChromPure™ Purified Proteins from Normal Serums）
ChromPure™蛋白主要用作一抗或二抗的實(shí)驗對照。它們也可用作Western blotting, IHC和IF的阻斷試劑。ChromPure™蛋白來源于未免疫動物的血清，不識別任何已知的抗原。它們是使用各種色譜技術(shù)制備的，以產(chǎn)生無污染分子觀察到的濃度高達(dá)20 mg/ml的材料，使它們成為最敏感的測定的實(shí)驗對照的理想選擇。ChromPure™蛋白可用于許多物種的各種格式，包括全免疫球蛋白，F(xiàn)(ab’)2和Fab片段。
人IgM、血清IgA和其他蛋白質(zhì)也可用。Jackson為該產(chǎn)品線提供了廣泛的偶聯(lián)物，包括一系列熒光染料和示蹤酶，允許從非特異性相互作用中分辨出信號。
相關(guān)產(chǎn)品推薦：
| 產(chǎn)品 | 貨號 | 規(guī)格 |
| ChromPure Mouse IgG, whole molecule | 015-000-003 | 5mg |
| ChromPure Bovine IgG, whole molecule | 001-000-003 | 10mg |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | 011-000-003 | 10mg |
· 單價Fab片段親和純化抗體
親和純化抗體fab片段可用于阻斷內(nèi)源性免疫球蛋白以減少背景染色和雙標(biāo)記來自同一宿主物種的主抗體。下面的例子展示了在小鼠組織上使用小鼠一抗時，如何使用Fab片段阻斷內(nèi)源性免疫球蛋白。
相關(guān)產(chǎn)品推薦：
| 貨號 | 產(chǎn)品名 | 規(guī)格 |
| 115-007-003 | AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | 1mg |
| 315-007-003 | AffiniPure Fab Fragment Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L) | 1mg |
· 牛血清蛋白（無IgG，無蛋白酶）
牛血清白蛋白(BSA)被廣泛用作稀釋抗體的載體蛋白，并在免疫測定和免疫檢測方案中作為一種常用的蛋白質(zhì)阻斷劑。如果牛血清蛋白是您的試驗所需的稀釋劑或阻斷劑，那么使用適合此目的的牛血清蛋白是很重要的。
牛IgG與山羊、綿羊和馬的IgG有許多共同的表位，可以成為針對這些物種的二抗的靶點(diǎn)(牛抗山羊IgG除外)。這也可能發(fā)生在與牛IgG有交叉反應(yīng)的其他抗體上。這些相互作用可能導(dǎo)致抗體活性的損失和/或背景增加。這些背景的產(chǎn)生可能來自于粘稠可溶性免疫復(fù)合物，或來自于因牛IgG蛋白的污染而產(chǎn)生的非特異性交叉反應(yīng)。
