原創(chuàng) Mabioway 文章來(lái)源：邁博睿

抗體通過(guò)其互補(bǔ)決定區(qū) (CDR) 相互作用，從而賦予特定抗原的高度特異性�？贵w的經(jīng)典結(jié)構(gòu)由四條鏈組成：兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈，每條鏈在可變區(qū)的末端含有三個(gè) CDR。其中，重鏈的第三個(gè) CDR 通常最為復(fù)雜，在基因水平上通過(guò) V（可變）、D（多樣性）和 J（連接）基因的組合進(jìn)行排列，這一過(guò)程稱(chēng)為 VDJ 重組。此外，這些區(qū)域特別容易發(fā)生體細(xì)胞超突變，這可以進(jìn)一步擴(kuò)展序列空間以引發(fā)針對(duì)病原體的免疫反應(yīng)。當(dāng)計(jì)算抗體序列空間的理論多樣性時(shí)，組合似乎是無(wú)限的。

用于治療目的的抗體的常用發(fā)現(xiàn)工具往往依賴(lài)于各種技術(shù)，但大致可分為體內(nèi)產(chǎn)生（例如動(dòng)物免疫、雜交瘤或供體來(lái)源（例如 PBMC））或體外選擇（例如噬菌體和酵母展示）。當(dāng)面對(duì)外來(lái)病原體時(shí)，B 細(xì)胞表面會(huì)顯示 1 型跨膜B 細(xì)胞受體，該受體通過(guò) VDJ 重組作為親和力成熟的前體。典型的估計(jì)是，人類(lèi)平均攜帶 1012–1015個(gè)抗體序列。然而，體外選擇的大小通常限制在 1010–1011，這仍然只是理論多樣性的一小部分。這些技術(shù)的對(duì)比在于，免疫理論上可以利用無(wú)限的多樣性，而體外文庫(kù)需要額外的工程和多輪選擇才能生成主要選定克隆的親和力成熟變體。

結(jié)構(gòu)生物學(xué)的最新進(jìn)展促進(jìn)了抗體發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的發(fā)展，并為抗體-抗原相互作用提供了寶貴的見(jiàn)解。首先，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)目前已存儲(chǔ)超過(guò) 160,000 個(gè)結(jié)構(gòu)，其中近 4000 個(gè)結(jié)構(gòu)屬于抗體或抗體-抗原復(fù)合物。在原子水平上檢查共結(jié)晶結(jié)構(gòu)可以清楚地了解控制抗體-抗原相互作用的精確靜電力和疏水力。我們將利用這些原理描述掃描抗體-抗原界面以調(diào)節(jié)這種相互作用親和力的方法。

在沒(méi)有晶體結(jié)構(gòu)的情況下，可以使用基于同源性和從頭算結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法洞察復(fù)雜結(jié)構(gòu)，但主鏈和/或側(cè)鏈構(gòu)象預(yù)測(cè)的不確定性可能導(dǎo)致親和力計(jì)算的不準(zhǔn)確性。一般來(lái)說(shuō)，模板和目標(biāo)序列之間的序列同一性以及可用模板結(jié)構(gòu)的質(zhì)量是同源性建模中的重要考慮因素。同樣，從頭算結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果也受到方法、力場(chǎng)和接觸勢(shì)的選擇的影響。將結(jié)合所提供的示例討論將同源性建模納入結(jié)構(gòu)親和力計(jì)算的敏感性。例如，我們將重點(diǎn)關(guān)注已發(fā)表的 DX-2930 親和力成熟研究，DX-2930 是一種抗血漿激肽釋放酶的抗體，該藥物于 2018 年獲得商業(yè)批準(zhǔn)，用于預(yù)防性治療遺傳性血管性水腫 。

有多種軟件包可用于執(zhí)行結(jié)構(gòu)建模和親和力計(jì)算，例如 MOE、BioLuminate 和 Rosetta。在本方法部分中，我們將重點(diǎn)介紹如何使用 MOE 。但是，許多一般原則都適用于這些不同的軟件平臺(tái)。

1、基于結(jié)構(gòu)的親和力成熟：一個(gè)實(shí)例
發(fā)現(xiàn)了一種抗血漿激肽釋放酶 (pKal) 的抗體 M0162-A04，其親和力為 5.39 nM。使用 VH-CDR3 內(nèi)的擺動(dòng)文庫(kù)進(jìn)行親和力成熟活動(dòng)，其中每個(gè)核苷酸有 85% 的機(jī)會(huì)保留為親本，有 5% 的機(jī)會(huì)切換到其他三個(gè)核苷酸中的每一個(gè)。隨后對(duì)變異文庫(kù)進(jìn)行噬菌體展示，產(chǎn)生了幾個(gè)相對(duì)于親本抗體具有改善親和力的克隆（表1）。最終，克隆 M0199-A08 被選為最終候選藥物。M0199-A08（也稱(chēng)為 DX-2930、lanadelumab）的晶體結(jié)構(gòu)已在 PDB 中公布，既有 Fab（4PUB），也有與 pKal（4OGX、4OGY）的共晶體 。作為本分析的起點(diǎn)，基于 4OGX 模板構(gòu)建了 M0162-A04 的同源性模型。如表1所示， M0162-A04 和 M0199-A08 之間的V H -CDR3中存在三處突變。此外，請(qǐng)注意，該示例旨在定義與抗原復(fù)合的整個(gè)抗體的殘基相互作用，但討論和分析將僅關(guān)注 V H -CDR3，因?yàn)橐延嘘P(guān)于該抗體的親和力成熟數(shù)據(jù)的公布。應(yīng)當(dāng)注意，在本示例中，有些突變不會(huì)增加親和力。相反，這些突變對(duì)親和力要么有中性影響，要么有有害影響。

表 1 該表最初發(fā)表于《生物化學(xué)雜志》
 

表 2 各突變對(duì) pKal 親和力總體變化倍數(shù)的影響總結(jié)

2、結(jié)果分析
表2總結(jié)了Kenniston 等人表1中的親和力數(shù)據(jù)，估計(jì)了每個(gè)氨基酸對(duì)親和力倍數(shù)變化的貢獻(xiàn)。一些突變具有很大程度的有效性，具體取決于序列中包含的其他突變。例如，表1中觀察到兩次 D110E 。在它的第一個(gè)實(shí)例中，在克隆 M0202-E03 中，它是唯一的突變，親和力從 5.39 nM 增加到 2.12 nM，代表有利的相互作用，增加了 2.5 倍。D110E 的第二個(gè)實(shí)例發(fā)生在 M0202-G03 中，現(xiàn)在它與 I103V 和 A108S 突變相結(jié)合，該克隆的親和力為 0.33 nM。然而，克隆 M0200-A10 僅包含 I103V 和 A108S 突變，其對(duì) pKal 的親和力為 0.23 nM。這意味著，當(dāng)直接比較 M0200-A10 和 M0202-G03 時(shí)，D110E 對(duì)相互作用略有不利影響。此處盡可能在單個(gè)突變的背景下估計(jì)倍數(shù)變化。因此，突變 D110E 被評(píng)為有利。一對(duì)突變 R99Q 和 D110N 無(wú)法與其他突變分離。這些突變中的每一個(gè)僅被選擇一次并出現(xiàn)在同一個(gè)克隆 (M0202-A12) 中。該克隆也可以直接與 M0200-A10 進(jìn)行比較，并顯示出更好的親和力 (0.23–0.09 nM)；因此，這兩個(gè)點(diǎn)突變體的組合被認(rèn)為是有利的，并且在本分析中，考慮它們的自由能總和，而不是它們各自的成分。

表2中的數(shù)據(jù)顯示，從定量角度來(lái)看，三種不同的殘基掃描設(shè)計(jì)方法表現(xiàn)相當(dāng)一致，這意味著自由能的符號(hào)在所有三種方法中都處于同一方向。將 KD 值轉(zhuǎn)換為自由能變化后，我們發(fā)現(xiàn)計(jì)算的自由能變化量和實(shí)驗(yàn)的自由能變化量之間沒(méi)有相關(guān)性。因此，我們只查看變化方向是否相同。大多數(shù)計(jì)算的自由能變化與測(cè)量的親和力變化相關(guān)，但有幾個(gè)明顯的例外：I103V 和 A108E。在這里，我們將分析這些殘基的預(yù)測(cè)，以及其他一些有趣的案例。

如本實(shí)驗(yàn)描述所述，4OGX 的結(jié)晶復(fù)合物含有 I101、V103 和 E108。在進(jìn)行殘基掃描之前，這些殘基分別通過(guò)同源建�；謴�(fù)突變?yōu)?T101、I103 和 A108。這些同源建模的殘基在三種殘基掃描方法中顯示出最大的自由能變化變化。例如，T101I 內(nèi)的突變都顯示出自由能的有利變化，與親和力的增加很好地相關(guān)。然而，低模式、動(dòng)力學(xué)和旋轉(zhuǎn)體計(jì)算的值分別為 -1.76、-4.43 和 -0.55 kCal/mol，顯示出很大的變化。I103V 突變體在三種方法中的計(jì)算結(jié)果分別為 +2、+5.42 和 +2.99 kCal/mol。不幸的是，這是子集中最重要的突變之一，因?yàn)閮H此突變就導(dǎo)致親和力增加了約 10 倍，從 5.39 nM 增加到 560 pM，因此此突變的 dAffinity 計(jì)算值非常正，這完全出乎意料。雖然 A108E 的變化幅度并不相同（親和力僅增加了兩倍），但計(jì)算結(jié)果還表明自由能變化的方向錯(cuò)誤，三種計(jì)算方法的范圍在 1.3 到 1.8 kCal/mol 之間。

我們假設(shè)，與這些殘基的同源性建模相關(guān)的細(xì)微變化是造成這些樣品中自由能分布高度可變的原因，并且可以幫助解釋實(shí)驗(yàn)觀察到的親和力變化與計(jì)算出的自由能值之間的差異。與更嚴(yán)格的自由能擾動(dòng)方法相比，MMGBSA 方法的局限性也可能是另一個(gè)促成因素。第三，抗原中 CDR3 環(huán)和表位殘基的移動(dòng)性可能無(wú)法在這些計(jì)算中完全捕獲。這些假設(shè)中的第一個(gè)很容易測(cè)試。我們準(zhǔn)備了 4OGX 晶體結(jié)構(gòu)，并使用低模式 MD 簡(jiǎn)單地執(zhí)行從 DX-2930 到 M0162-A04 的突變，以計(jì)算 I101T、V103I 和 E108A 的自由能變化。這三種突變都應(yīng)導(dǎo)致親和力降低，因此應(yīng)該對(duì)自由能產(chǎn)生正向變化。I101T (0.65 kCal/mol) 和 E108A (0.6 kCal/mol) 均同意這一假設(shè)，而 V103I (−0.3 kCal/mol) 實(shí)際上比使用同源模型殘基時(shí)更接近于零。圖1顯示 I103 模型更適合 pKal 殘基 478-480、Y555 和 W598 組成的口袋。考慮到異亮氨酸上的額外甲基有助于增加范德華接觸，在這種情況下計(jì)算出的能量為 −0.3 kCal/mol 似乎是合理的。然而，親和力的急劇變化很難從生物物理和計(jì)算的角度來(lái)理解。

圖1 同源模型中的 I103（綠色）與 4OGX 中的 V103（紅色）的疊加

圖2 DX-2930 E108 與未最小化共晶體結(jié)構(gòu)中的血漿激肽釋放酶 K575 相互作用 ( a )。同源性建模和最小化后的抗體 A108 ( b )。轉(zhuǎn)換為 E108 后低模式 MD 分析的輸出構(gòu)象 ( c )。a 、b和c的疊加顯示，E108 和 K575 的天然相互作用被破壞，因?yàn)樵谶@些模擬中 K575 的軌跡向 pKal 結(jié)構(gòu)回縮，從建模和最小化開(kāi)始短暫，但在殘留掃描期間加速

盡管從親和力未成熟親本的同源模型重建 DX-2930 存在這些顯著的失敗，但這些數(shù)據(jù)中還是有幾個(gè)成功案例。在位置 103，Ala、Ser 和 Leu 是經(jīng)過(guò)改造的變體，旨在降低抗體對(duì) pKal 的親和力，并且這些殘基中的每一個(gè)都顯示出強(qiáng)烈的正向自由能變化。然而，使用同源模型不利于自由能計(jì)算的邏輯，還使用 4OGX 晶體結(jié)構(gòu)中 V103 的低模式 MD 計(jì)算了這三個(gè)突變的 dAffinity。在這里，與殘基相關(guān)的自由能變化為 Ala +4.78 kCal/mol、Leu +1.12 kCal/mol 和 Ser +0.16 kCal/mol。此位置的丙氨酸將親和力降低至 228 nM，這與自由能的大幅變化很好地相關(guān)。同樣，L103 對(duì)應(yīng)的親和力略微下降至 12 nM，反映出突變后自由能略微增加。另一方面，絲氨酸的親和力變化最為劇烈（913 nM），但自由能計(jì)算并未反映出這一點(diǎn)，因?yàn)檫@種突變被認(rèn)為在能量上與 V103 一致。

3、使用計(jì)算機(jī)計(jì)算生成庫(kù)
如本例所示，親和力成熟的輸入是描述兩種蛋白質(zhì)之間相互作用的結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)行計(jì)算機(jī)殘基掃描，從而輸出突變及其相關(guān)的結(jié)合自由能變化。對(duì)于上一節(jié)中描述的工作示例，小于零的自由能變化通常預(yù)示著有助于增加親和力的替換，而大于零的自由能變化通常表示突變降低了兩種蛋白質(zhì)的親和力。

下一個(gè)挑戰(zhàn)是評(píng)估計(jì)算機(jī)突變分析的輸出并生成一個(gè)要淘選的物理文庫(kù)，這需要了解文庫(kù)大小和淘選方法的限制。在上面描述的例子中，66 個(gè) CDR 殘基中有 46 個(gè)與 pKal 接觸。按 dAffinity 排序，并取 -0.5 kCal/mol 的任意截止值，共有 233 個(gè)推定的突變，平均每個(gè)位點(diǎn)約有 5 個(gè)突變，不包括親本殘基（數(shù)據(jù)未顯示）�；�于這些近似值，理論文庫(kù)多樣性估計(jì)為 6 46，相當(dāng)于 6.2 × 10 35的大小。鑒于典型噬菌體文庫(kù)的大小在 10 10的數(shù)量級(jí)，這個(gè)數(shù)字是天文數(shù)字，無(wú)法物理合成用于淘選，而且這個(gè)文庫(kù)的采樣將非常差。然而，在設(shè)計(jì)文庫(kù)時(shí)，其他考慮因素（例如預(yù)先選擇抗體-抗原界面或 CDR 上的較少位置、最大限度地利用種系殘基、可開(kāi)發(fā)性以及消除潛在的化學(xué)降解傾向）可以大大減少計(jì)算設(shè)計(jì)文庫(kù)的理論大�。ㄉ院蠼榻B）。例如，使用一般對(duì)抗網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)的文庫(kù)能夠同時(shí)考慮可開(kāi)發(fā)性和抗原結(jié)合。

此外，在計(jì)劃構(gòu)建親和力成熟文庫(kù)時(shí)，還應(yīng)考慮其他實(shí)驗(yàn)策略。合成各種 DNA 寡核苷酸池已成為抗體親和力成熟的常用技術(shù)，并且在過(guò)去十年中，這些池的創(chuàng)建精度已大大提高。這些服務(wù)在大多數(shù) DNA 合成供應(yīng)商中很常見(jiàn)，不同的技術(shù)對(duì)單個(gè) DNA 鏈合成精度的控制程度不同。對(duì)這些單個(gè)技術(shù)的評(píng)估超出了本章的范圍。為了更深入地探究理論上的多樣性，可以針對(duì)每個(gè)單獨(dú)的 CDR 構(gòu)建文庫(kù)以篩選親和力更高的結(jié)合物。此過(guò)程專(zhuān)門(mén)用于生成 DX-2930，如上例所示，其中文庫(kù)專(zhuān)門(mén)針對(duì) VH - CDR3（盡管此例中的文庫(kù)是使用核苷酸序列的加權(quán)隨機(jī)化生成的，而不是受到計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的影響）。盡管如此，為每個(gè) CDR 和 CDR 組合（例如整條重鏈或整條輕鏈）創(chuàng)建文庫(kù)是篩選親和力增加的常用技術(shù)。這些單獨(dú)選擇的輸出可以與標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)過(guò)程相結(jié)合，并且可以生成一個(gè)新的文庫(kù)，其潛力甚至比單個(gè)組件文庫(kù)實(shí)現(xiàn)更高的親和力。

從另一個(gè)角度來(lái)看，可以通過(guò)限制某些殘基組合來(lái)降低文庫(kù)的復(fù)雜性，特別是那些可能導(dǎo)致假定缺陷的組合，例如氧化、脫酰胺、異構(gòu)化和糖基化。通過(guò)避免這些基序來(lái)減少理論多樣性有時(shí)可以大大減少搜索空間。本書(shū)、Thorsteinson 撰寫(xiě)的一章以及文獻(xiàn)全面回顧了基于計(jì)算機(jī)的可開(kāi)發(fā)性方法。最后，還可以通過(guò)對(duì)計(jì)算出的自由能變化設(shè)置更嚴(yán)格的過(guò)濾器來(lái)降低庫(kù)的復(fù)雜性。如果一個(gè)（或多個(gè)）CDR 具有大量與抗原相互作用的殘基，這可能尤為重要。相反，可以對(duì)僅與抗原形成幾個(gè)相互作用的 CDR 應(yīng)用較不嚴(yán)格的過(guò)濾器，從而在該區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生更大的多樣性。

文庫(kù)構(gòu)建是一門(mén)藝術(shù)和一門(mén)科學(xué)之間的平衡，沒(méi)有一種親和力成熟策略能夠廣泛涵蓋與改善抗體與其抗原之間的相互作用相關(guān)的理論多樣性。然而，我們希望本節(jié)能為采樣廣闊的序列空間提供一些合理的見(jiàn)解，以期提高抗體與其抗原之間的親和力。

4、未來(lái)方向
親和力成熟是優(yōu)化新發(fā)現(xiàn)的先導(dǎo)候選物過(guò)程中的一個(gè)重要步驟。該分析表明，科學(xué)家可以合理地定義突變集，以創(chuàng)建一個(gè)變體庫(kù)，這將有助于提高抗體-抗原相互作用的親和力。執(zhí)行此類(lèi)任務(wù)的關(guān)鍵要求之一是抗體和抗原之間的共結(jié)晶復(fù)合物。正如本例中觀察到的，該方法的可靠性需要精確布局兩種蛋白質(zhì)之間的原子相互作用。可以使用同源性建模，但如果 CDR 中各個(gè)氨基酸的主鏈和側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體構(gòu)象沒(méi)有精確定義，結(jié)果可能會(huì)變得不那么可靠。此外，目視檢查原子接觸可以幫助引導(dǎo)殘基并入庫(kù)中。

對(duì)于本章中的示例，在重新創(chuàng)建從 M0162-A04 親和力成熟庫(kù)中選擇的點(diǎn)突變時(shí)存在挑戰(zhàn)。當(dāng)然，與在開(kāi)始此練習(xí)之前模擬三個(gè)回復(fù)突變相比，擁有 M0162-A04 和血漿激肽釋放酶的共結(jié)晶復(fù)合物可能有助于闡明這兩種蛋白質(zhì)之間的接觸。特別是，導(dǎo)致親和力增加十倍的 I103V 突變可能仍然難以預(yù)測(cè)。然而，該方法表明，生成可以提高親和力的庫(kù)實(shí)際上是相當(dāng)可行的，尤其是當(dāng)引入其他在計(jì)算機(jī)中生成的能量有利突變時(shí)，但由于未在表1中列出，因此不屬于此分析的一部分。

由于該方法需要精確的分子相互作用來(lái)進(jìn)行自由能計(jì)算，因此這一新興領(lǐng)域的未來(lái)方向很明確：抗體-抗原復(fù)合物預(yù)測(cè)的改進(jìn)可以大大提高計(jì)算機(jī)計(jì)算的有效性，從而實(shí)現(xiàn)更好的庫(kù)設(shè)計(jì)。隨著結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的改進(jìn)，本章中的方法可以應(yīng)用于由抗體和抗原的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對(duì)接同源性模型產(chǎn)生的預(yù)測(cè)抗體-抗原復(fù)合物，以生成計(jì)算機(jī)親和力成熟庫(kù)。