克隆性造血屬于血液腫瘤的癌前病變狀態(tài)，越來越多的研究發(fā)現，克隆性造血會隨著個體的衰老而不斷加劇，因而也被稱為衰老相關克隆性造血。克隆性造血的個體發(fā)生白血病的風險較正常人增加了10倍，并出現髓系細胞分化偏向性，從而導致系統(tǒng)性慢性炎癥，進而使得炎癥相關疾病如動脈粥樣硬化、心肌梗死以及中風的發(fā)生率提高了約1倍^[1-3]。而全身性的慢性炎癥反過來加劇克隆性造血的進展，從而形成一個惡性循環(huán)（圖1）。

克隆性造血發(fā)生率隨著年齡增大而增加，并伴隨著很多關鍵基因的突變，其中DNMT3A在多個研究中都顯示為突變頻率最高的基因^[4]。DNMT3A可測到的突變位點多達190個，其中R882位點突變在克隆性造血個體中占17%，在急性髓系白血�。ˋML）個體中占比高達50%^[5]。由于克隆性造血為白血病的癌前病變狀態(tài)，由此說明攜帶R882突變的克隆性造血患者更容易轉化為白血病^[6,7]。那么，DNMT3A突變頻率隨著衰老不斷增加的分子機制尚不明確。
 

研究材料
在這項研究中，研究人員使用了Dnmt3a^fl-R878H/+小鼠（由賽業(yè)生物提供）、Vav-iCre小鼠、Mlkl^-/-小鼠、Ripk1^K45A小鼠、Ripk3^Δ/Δ小鼠、CD45.1小鼠以及CD45.1/2小鼠。

技術方法
本項研究主要采用了流式分析、流式分選、全骨髓競爭移植、LPS炎癥模型、體外培養(yǎng)造血干及祖細胞、細胞因子芯片檢測、蛋白質印跡以及實時定量PCR研究方法。

技術路線
 

 

研究結果

1.衰老的骨髓促進DNMT3A R878H驅動的克隆性造血
研究者從年輕的R878H小鼠（即Dnmt3a^fl-R878H/+, Vav-icre⁺，其中Dnmt3a^fl-R878H/+小鼠由賽業(yè)生物提供，通過ES打靶技術構建）中提取骨髓細胞，連同正常的競爭者骨髓細胞移植到年輕與年老的受體小鼠中。結果顯示，R878H骨髓細胞在年老受體小鼠中重建率更高，而WT細胞則沒有明顯差異（圖2），說明年老的骨髓微環(huán)境促進了R878H誘導的克隆性造血。那么到底是年老骨髓中什么因素促進了R878H細胞的克隆性擴增呢？
 

2.LPS誘導的慢性炎癥促進R878H驅動的克隆性造血
近些年來，普遍認為衰老與炎癥密切相關，因此有了炎性衰老（Inflamm-aging）的概念。那么，R878H細胞在年老骨髓中的克隆性擴增是否與年老的骨髓炎癥微環(huán)境增強相關呢？為此，研究者分別用LPS模擬急性和慢性炎癥刺激。發(fā)現R878H HSC對于急性炎癥刺激的響應明顯下降，而慢性炎癥刺激可以促進R878H細胞驅動的克隆性造血（圖3）。
 

圖3 LPS誘導的慢性炎癥促進R878H驅動的克隆性造血

3.R878H HSC抵抗TNFα誘導的細胞損傷
研究者分別取年輕和年老受體小鼠的骨髓上清做細胞因子芯片分析，發(fā)現其中TNFα信號通路在年老骨髓中顯著上調。進一步研究發(fā)現，R878H HSC可以抵抗TNFα誘導的細胞損傷（圖4），證明TNFα是年老骨髓微環(huán)境中促進R878H細胞克隆性擴增的主要炎癥因子。
 

圖4 R878H HSC抵抗TNFα誘導的細胞損傷

4.Dnmt3a R878H細胞抵抗細胞程序性壞死激活
研究者將年老受體骨髓中的LSK細胞分選出來做RT-PCR，分別檢測TNFα信號下游相關的通路基因的表達，發(fā)現凋亡通路的Fadd和Caspase-8以及細胞程序性壞死通路的Ripk1和Ripk3表達下降（圖5），說明凋亡和程序性壞死通路在R878H細胞中受到了抑制。進一步研究發(fā)現，R878H細胞能夠部分抵抗細胞程序性壞死，而不是凋亡（圖5），說明Dnmt3a R878H細胞通過抵抗細胞程序性壞死的激活而獲得增殖優(yōu)勢。

研究結論
在這項研究中，研究者利用造血干細胞競爭性移植和LPS誘導的炎癥模型來檢測炎癥和衰老微環(huán)境對DNMT3A R878H驅動的克隆性造血的作用，觀察到R878H骨髓細胞在衰老的骨髓微環(huán)境和炎癥侵襲時表現出增強的重建能力，發(fā)現R878H造血干及祖細胞通過抵抗由TNFα誘導、RIPK1–RIPK3–MLKL介導的細胞程序性壞死而促進R878H驅動的克隆性造血，而衰老上調的炎癥信號（主要為TNFα信號）可以加速這一過程（圖6）。

該研究系統(tǒng)性地從DNMT3A R878H小鼠模型的構建，到DNMT3A R882突變引發(fā)衰老相關克隆性造血的機制研究，解析了衰老進程中DNMT3A hR882H/mR878H突變導致造血干細胞克隆性增生的分子生物學機制，對DNMT3A突變及其他相關突變驅動的克隆性造血及白血病研究具有一定的指導意義。
 

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參考文獻：

[1]Genovese G, Kähler A K, Handsaker R E, et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence[J]. N Engl J Med, 2014, 371(26): 2477-2487.

[2]Jaiswal S, Fontanillas P, Flannick J, et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes[J]. N Engl J Med, 2014, 371(26): 2488-2498.

[3]Jaiswal S, Natarajan P, Silver A J, et al. Clonal Hematopoiesis and Risk of Atherosclerotic Cardiovascular Disease[J]. N Engl J Med, 2017, 377(2): 111-121.

[4]Bick A G, Weinstock J S, Nandakumar S K, et al. Inherited causes of clonal haematopoiesis in 97,691 whole genomes[J]. Nature, 2020, 586(7831): 763-768.

[5]Brunetti L, Gundry M C, Goodell M A. DNMT3A in Leukemia[J]. Cold Spring Harb Perspect Med, 2017, 7(2).

[6]Miles L A, Bowman R L, Merlinsky T R, et al. Single-cell mutation analysis of clonal evolution in myeloid malignancies[J]. Nature, 2020, 587(7834): 477-482.

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原文檢索：

MinLiao, RuiqingChen, YangYang, et al. Aging-elevated inflammation promotes DNMT3A R878H-driven clonal hematopoiesis. Acta Pharmaceutica Sinica B. Volume 12, Issue 2, February 2022, Pages 678-691.https://doi.org/10.1016/j.apsb.2021.09.015