美國研究人員Nhan Le等開發(fā)了一種集成的多功能成像系統(tǒng)，使用該系統(tǒng)，能夠在眼科應(yīng)用中實(shí)現(xiàn)活體內(nèi)解剖（OCT）、功能（OCTA）和分子成像（LIAF）。其中LIAF使用藍(lán)色激發(fā)光（405 nm），OCT提供1310 nm掃描激光源。帶有450 nm切入式寬帶濾光片的RGB數(shù)碼相機(jī)用于LIAF探測。激發(fā)光源和相機(jī)與OCT探頭直接集成在一起。不但保持了檢測健康牙齒和低礦化牙齒之間的差異、識(shí)別牙齒生物膜和可視化牙齦組織微血管的能力，集成系統(tǒng)還提高了體內(nèi)OCT數(shù)據(jù)收集的速度，并能夠更好地瞄準(zhǔn)ROI區(qū)域。集成OCT-LIAF系統(tǒng)為臨床研究提供了更多信息和便利性，方便操作者更好的檢查口腔狀況隨時(shí)間的變化情況。文章以“Non-invasive multimodal imaging by integratingoptical coherence tomography with autofluorescence imaging for dental applications”為題發(fā)表于Journal of Biophotonics。

  背景

 目前對(duì)牙周健康和疾病狀況的監(jiān)測主要通過牙科專業(yè)人員依靠視覺和觸覺評(píng)估來進(jìn)行。臨床評(píng)估基于顏色、質(zhì)地、探查出血、牙齦組織腫脹、牙周袋深度和附著性測量。早在20世紀(jì)80年代早期，就已經(jīng)開發(fā)出了一系列非破壞性和非侵入性成像方法，可用于檢測早期齲齒病變，如激光誘導(dǎo)自熒光。當(dāng)時(shí)人們已知紫外線和藍(lán)色激發(fā)后牙齒會(huì)發(fā)出熒光，使用488 nm激光對(duì)釉質(zhì)病變進(jìn)行成像非常普遍。發(fā)出的誘導(dǎo)熒光處于光譜的綠色或紅色區(qū)域。綠色自熒光源于牙本質(zhì)層膠原蛋白，而紅色熒光源于細(xì)菌代謝產(chǎn)物，主要是牙菌斑膜上的卟啉等。當(dāng)釉質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)齲齒時(shí)，病變會(huì)吸收并散射激發(fā)光，導(dǎo)致自熒光強(qiáng)度較低。雖然LIAF能夠充分檢測牙釉質(zhì)病變和成熟的牙菌斑，但不能直接提供深度信息，因此，如果能直接測量出病變深度，對(duì)牙齒狀況會(huì)有更準(zhǔn)確更有效的評(píng)估。

 OCT是一種相對(duì)較新的醫(yī)學(xué)成像方式，在眼科和牙科臨床應(yīng)用中都獲得很好的效果。典型的OCT系統(tǒng)與斷層掃描技術(shù)類似，能夠進(jìn)行體積式掃描，揭示掃描表面下的潛在結(jié)構(gòu)特征。OCT系統(tǒng)通常采用近紅外至紅外光源（600-1400 nm）提取生物組織的散射特性，能夠以幾微米的分辨率對(duì)生物組織表面以下2 mm的微結(jié)構(gòu)成像，通常在組織中的軸向分辨率為6 μm，橫向分辨率取決于掃描光學(xué)器件從12至50 μm不等。眼科相關(guān)疾病的診斷和監(jiān)測中應(yīng)該非常普遍，例如黃斑變性、青光眼和糖尿病視網(wǎng)膜病變。牙科臨床中，同樣被用于識(shí)別齲齒和牙結(jié)石，測量齦溝的深度，表征牙周組織輪廓。

 早在20世紀(jì)80年代中期人們就將干涉測量法用于眼科研究，后不斷開發(fā)和完善并用于眼科醫(yī)學(xué)成像。在眼科引入OCT后，皮膚科、腦、癌癥影像學(xué)等諸多其他領(lǐng)域開始研究其臨床應(yīng)用潛力。OCT在20世紀(jì)90年代后期被用于牙周病學(xué)。然而大多數(shù)牙齦組織的OCT研究僅限于研究組織的解剖結(jié)構(gòu)。最近的研究已經(jīng)將OCT技術(shù)應(yīng)用于臨床，以評(píng)估作為治療功能的軟組織和硬組織的變化。

 OCT中的功能性血管造影（OCTA）技術(shù)可以對(duì)牙齦組織內(nèi)的脈管系統(tǒng)成像。然而，高分辨率OCT技術(shù)對(duì)掃描區(qū)域具有高度特異性，因此受限于小視場（~ 8 mm × 8 mm），而小視場雖然分辨率高（微米和毛細(xì)管水平尺度），但很難與臨床視覺評(píng)估進(jìn)行直接比較。除此之外，考慮到OCT的高分辨率能力，參與者的呼吸活動(dòng)也可能會(huì)干擾測量；在一些關(guān)鍵性的牙齒區(qū)域，操作者的視線被遮擋，OCT探針布置較難。本研究通過在OCT系統(tǒng)中集成LIAF來解決這些問題，使操作者可靠地瞄準(zhǔn)感興趣的區(qū)域，并抵消由于患者呼吸或其他形式的運(yùn)動(dòng)引起的任何移動(dòng)。從而提高OCT系統(tǒng)的可靠性，減少探頭對(duì)準(zhǔn)時(shí)間，從而獲得統(tǒng)一、聚焦、高質(zhì)量3D圖像，為臨床評(píng)估提供有價(jià)值的信息。

  結(jié)果

 01-光誘導(dǎo)的熒光成像

 LIAF-OCT集成系統(tǒng)中，OCT可提供牙菌斑的總體信息，LIAF可檢測更成熟和更具潛在致病性的斑塊。牙齒結(jié)構(gòu)異常方面，OCT可提供牙齒三維高分辨圖像，LIAF可通過綠色熒光的變化反映牙齒結(jié)構(gòu)異常。

 圖3為低礦化區(qū)和健康牙齒的LIAF圖像。其中藍(lán)色是LIAF光源的直接反射的結(jié)果。熒光圖像可見低礦化區(qū)域顯示為棕色斑塊，綠色自熒光顯著減少（圖3A）。將綠色和紅色通道獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)一步處理并以灰度顯示，可見健康牙釉質(zhì)呈現(xiàn)為亮白色，低礦化區(qū)亮度較低（圖3B）。與圖3A中健康和低礦化區(qū)域位置相對(duì)應(yīng)。低礦化區(qū)域還產(chǎn)生紅色自熒光，在圖3C中被感知為灰色區(qū)域（550-700 nm，620 mm峰）。已知紅色自發(fā)熒光與細(xì)菌感染有關(guān)，卟啉是細(xì)菌代謝的產(chǎn)物，會(huì)積累并產(chǎn)生紅色自動(dòng)熒光。圖3C中低礦化區(qū)域的紅色自熒光弱于齒間和牙齦邊緣區(qū)域（箭頭），即生物膜積累的區(qū)域。該區(qū)域由于沒有牙齒結(jié)構(gòu)抑制光發(fā)射，因此紅色自熒光更強(qiáng)。這些觀察結(jié)果與之前文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果非常一致。
 

 

圖3 （A）3通道相機(jī)的原始熒光圖像（520 nm濾光片）。（B）綠色通道（450-600 nm, 520 nm峰）。（C）紅色通道（550-800 nm, 640 nm峰）。

為證明斑塊自熒光對(duì)比增強(qiáng)法（plaque-autofluorescence contrast enhancement, PAF）在該集成系統(tǒng)中的作用，在刷牙前后對(duì)健康牙齒的牙菌斑情況進(jìn)行了成像研究。志愿者在圖像采集的早上沒有刷牙，在左犬齒（近頰側(cè)）檢測到牙菌斑。第一次圖像采集后，立即徹底刷牙以清除牙菌斑。

PAF法利用rLIAF（紅色通道）和gLIAF（綠色通道）中自熒光強(qiáng)度的差異。在牙齒樣本中（圖4A），平均rLIAF強(qiáng)度為46，平均gLIAF強(qiáng)度為135；而斑塊樣品中二者平均強(qiáng)度都約為80（圖4B）。由于牙齒的熒光光譜較寬，其熒光峰值在綠色光譜中，致使絕大多數(shù)信號(hào)出現(xiàn)在綠色檢測通道（gLIAF）中，紅色檢測通道（rLIAF）中只有少量的低強(qiáng)度信號(hào)。鑒于紅色和綠色通道中的自熒光強(qiáng)度遵循線性比例關(guān)系，因此引入PAF步驟，通過如下公式將紅色通道圖像從綠色通道圖像中減去，進(jìn)一步增強(qiáng)牙齒和牙斑的自熒光之間的差異：



其中I_PAF、I_R、I_G分別為增強(qiáng)后的斑塊自熒光強(qiáng)度、紅色通道（rLIAF）和綠色通道（gLIAF）強(qiáng)度，校準(zhǔn)常數(shù)k通常＜1，xy為圖像中像素位置。   
圖4. （A，B）紅色綠色通道以及PAF法的直方圖。鑒于牙齒和斑塊在不同自熒光光譜中強(qiáng)度不同，PAF法能將牙齒自熒光減少到基線值（0）并增強(qiáng)斑塊自熒光的對(duì)比度。（C，D）原始數(shù)據(jù)圖像。（E，F(xiàn)）紅色自熒光顯示牙齒也有很亮的自熒光，可能會(huì)減少斑塊自熒光的對(duì)比度。（G，H）增強(qiáng)斑塊可視化的的PAF法處理后的斑塊圖像。

圖4C和4D為原始圖像，由于牙齒的自熒光譜相對(duì)較寬，牙菌斑rLIAF中包含了來自牙齒的強(qiáng)背景噪聲，需要進(jìn)一步處理以進(jìn)行可視化。圖4G和4H為在斑塊區(qū)域應(yīng)用PAF算法后得到的對(duì)比增強(qiáng)圖像。

通過使用PAF算法使來自牙齒的像素強(qiáng)度接近于零（圖4A），而來自牙斑的像素（圖4B）移動(dòng)到非零值，從而改善斑塊的可視化效果，在定量測量中，該方法較手動(dòng)分割更為簡便。經(jīng)測量刷牙前后的菌斑面積值（N=10）分別為4.34±0.13 mm²和1.60±0.18 mm²，平均PAF強(qiáng)度分別為45.1±0.55和18.65±0.50。刷牙后，牙菌斑面積和PAF強(qiáng)度都顯著降低。

以上結(jié)果證明該集成系統(tǒng)能夠使用綠色自熒光檢測牙釉質(zhì)脫礦、使用紅色自熒光檢測斑塊（生物膜）的存在。且所有成像都可以實(shí)時(shí)按需進(jìn)行。

  02-PAF和OCT對(duì)牙菌斑的定性觀察

與LIAF類似，OCT也可以檢測牙齒結(jié)構(gòu)的變化和牙齒表面菌斑的積聚，此外OCTA還能提供牙齦組織的結(jié)構(gòu)和血管信息。在OCT中，斑塊由于亮度不連續(xù)，能夠與周圍（軟/硬）組織區(qū)分開來，在正面投影和B-frame上可見暗條紋（圖5）。在OCT B-frame中，牙菌斑位于游離齦和牙齒之間，此處由于牙菌斑存在，牙齦出現(xiàn)輕微移位。斑塊上似乎也可見一層20-30 μm厚的透明薄膜。在OCT正面投影中，牙斑呈平滑明亮的區(qū)域，特點(diǎn)是比牙釉質(zhì)更亮（具有更高的散射特性）、紋理比周圍軟組織更平滑、齒間亮度不連續(xù)。OCT成像深度為表面下100 μm，該深度下牙斑面積完整，牙釉質(zhì)層可以容易地與牙菌斑區(qū)分開，并且軟組織中的脈管系統(tǒng)可以提供部分軟組織炎癥信息。
 

 

圖5 頰側(cè)齒間牙齦（左門牙和側(cè)門牙之間）自熒光成像和OCT成像的對(duì)比。

 

與PAF圖像相比，OCT圖像中牙菌斑表面積看起來更大。OCT能夠成像總斑塊，而PAF只檢測由產(chǎn)生卟啉的細(xì)菌菌株組成的斑塊。因此將PAF作為唯一的評(píng)估技術(shù)可能無法準(zhǔn)確評(píng)估牙菌斑存在情況，但可以追蹤斑塊生物膜的生長及其活性。

 在介入和基于縱向的臨床研究中，圖像配準(zhǔn)非常重要。LIAF可以在掃描過程中引導(dǎo)OCT探頭（圖6），以確保采集數(shù)據(jù)的可靠性，即在患者隨訪的不同次掃描之間有良好的重疊性（至少80%重疊）。同時(shí)LIAF引導(dǎo)還能幫助操作者快速識(shí)別和定位口腔組織上的感興趣區(qū)域。

 

圖6 使用LIAF相機(jī)為OCT探針對(duì)準(zhǔn)進(jìn)行“粗配準(zhǔn)”的舉例。探針根據(jù)重疊的邊緣檢測圖像對(duì)準(zhǔn)。對(duì)準(zhǔn)使OCT和OCTA數(shù)據(jù)有良好的重疊用于點(diǎn)云配準(zhǔn)。

 

在臨床實(shí)用性方面，LIAF不但可幫助操作者識(shí)別口腔組織中出現(xiàn)異常的區(qū)域，并允許快速捕獲OCT圖像，大大減少了掃描時(shí)間，有助于改善患者體驗(yàn)。本研究記錄了整合LIAF前后的掃描時(shí)間（表1），共10名患者（整合LIAF前后各5名），發(fā)現(xiàn)整合LIAF后，瞄準(zhǔn)感興趣區(qū)域的平均時(shí)間減少了111s（約2 min）。掃描間差異也減少了，意味著在患者不自主運(yùn)動(dòng)存在的情況下，依舊可靠地重新瞄準(zhǔn)感興趣區(qū)域。
 

 

03-PAF、OCT和OCTA對(duì)牙菌斑的定性觀察
為展示LIAF-OCT系統(tǒng)的全部功能，對(duì)比PAF、OCT和OCTA三種不同成像模式下斑塊和周圍組織的成像結(jié)果。成像部位是左側(cè)切牙和左犬齒的齒間區(qū)域。
 

 

圖7 （A，B）PAF成像的原始和后處理數(shù)據(jù)，顯示存在牙菌斑。（C）正面OCT圖像（表層150 μm以下）可見牙菌斑的位置，以及周圍組織。（D）功能性O(shè)CTA提供微血管結(jié)構(gòu)信息，可見柔軟組織沒有炎癥或炎癥極輕。（E，F(xiàn)）圖C中綠色虛線位置的OCT B-scan圖像。

 LIAF原始圖像（圖7A）經(jīng)后處理顯示存在牙菌斑（圖7B）。OCT（圖7C）和OCTA（圖7D）圖像分別展示了牙齦邊緣的微結(jié)構(gòu)和微脈管系統(tǒng)，可見牙齦邊緣微結(jié)構(gòu)呈明亮且光滑狀態(tài)（圖7C紅色虛線）。幾種成像方法得到斑塊面積相似（表2）。正面OCT圖像可顯示斑塊的最大面積，因此選擇它來與LIAF測量的斑塊進(jìn)行比較。大部分誤差是由人工分割引起的，因?yàn)椴僮髡弑仨毮恳曔x擇要分析的區(qū)域（圖7B和圖7C）。基于這種方法，PAF和OCT在測量齦上菌斑方面沒有顯著差異（2-way t-test，p<0.05）。平均值不同可能是儀器讀數(shù)和測量方法誤差所致。
 

 

OCT可以在血管造影術(shù)模式（OCTA）下運(yùn)行，并以微米分辨率提供牙齦的3D脈管系統(tǒng)圖像。在炎癥過程中，血管增殖或血管舒張，導(dǎo)致炎癥部位的毛細(xì)血管更多和/或血管更大。已知牙齦炎癥可以通過OCT和OCTA成像在活體內(nèi)進(jìn)行觀察和定量。當(dāng)OCT/OCTA與PAF聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，有可能評(píng)估牙齦邊緣周圍更具致病性的牙菌斑的初始發(fā)病情況，以及由此導(dǎo)致的牙齦結(jié)構(gòu)和脈管系統(tǒng)的變化。

 斑塊積聚24h似乎不會(huì)在周圍組織中引發(fā)任何可辨別的炎癥反應(yīng)，但也確實(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)締組織產(chǎn)生不規(guī)則紋理，如正面OCT上的黑色條紋（圖7C黃色虛線），OCTA微血管圖像（圖7D）進(jìn)一步證實(shí)了這種異常，與該狹窄區(qū)域內(nèi)的正常/健康區(qū)域相比，小毛細(xì)血管的數(shù)量減少。然而尚不清楚牙齦OCTA外觀與斑塊積聚有何聯(lián)系，也許該微分辨率下的異常只是單純的個(gè)體解剖特征。圖7中給出的結(jié)果也證明了這兩個(gè)系統(tǒng)作為互補(bǔ)對(duì)工作。由于OCT對(duì)光散射引起的組織光學(xué)特性敏感，因此由于其不同的光學(xué)特性，它可用于區(qū)分斑塊和周圍組織，從而測量總斑塊。另一方面，PAF提供了斑塊內(nèi)卟啉數(shù)量的信息，表明了細(xì)菌的代謝產(chǎn)物。例如，在犬科部位（圖7B中的黃色箭頭）比在門牙部位（圖7B中的藍(lán)色箭頭）觀察到更多的細(xì)菌代謝活性。然而，通過OCT對(duì)牙齦邊緣位置的牙菌斑的厚度測量分別為330μm（圖7F）和197 μm（圖7E）。

  結(jié)論
LIAF-OCT集成系統(tǒng)滿足了3D微成像所需的快速、寬視野、高性價(jià)比需求，可以解決臨床中的諸多問題，如快速準(zhǔn)確定位感興趣結(jié)構(gòu)、控制受試者的不自主運(yùn)動(dòng)、減少成像時(shí)間，此外還有檢測生物膜累積情況等。在臨床口腔狀況跟蹤中，LIAF-OCT系統(tǒng)具有非常大的應(yīng)用潛力。隨著技術(shù)的發(fā)展，該集成系統(tǒng)將幫助臨床對(duì)病變狀態(tài)做出更準(zhǔn)確的評(píng)估和解釋。

 

參考文獻(xiàn)：

Le, Nhan , et al. "Noninvasive multimodal imaging by integrating optical coherence tomography with autofluorescence imaging for dental applications." Journal of Biophotonics (2020):e202000026.