日本京都大學(xué)醫(yī)學(xué)研究生院Yasunori Hayashi研究組取得最新進(jìn)展。他們揭示了逐步突觸可塑性事件可驅(qū)動(dòng)記憶鞏固的早期階段。這一研究成果于2021年11月12日在Science上發(fā)表：Stepwise synaptic plasticity events drive the early phase of memory consolidation。研究人員使用Inscopix自由活動(dòng)鈣成像顯微鏡觀察到了海馬體的LTP過(guò)程在記憶形成和記憶鞏固中具有重要作用，并通過(guò)一種新的神經(jīng)光學(xué)技術(shù)成功消除了小鼠的記憶，并證明了在記憶鞏固的早期階段，長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）的精確定位、時(shí)間和特征對(duì)記憶的形成是至關(guān)重要的。

 

摘要

記憶最初編碼在海馬中，但隨后鞏固到大腦皮層。雖然突觸可塑性是這些過(guò)程的關(guān)鍵，但其精確的時(shí)空分布仍不清楚。利用Inscopix自由活動(dòng)鈣成像顯微技術(shù)和光遺傳學(xué)方法在一個(gè)確定的時(shí)間窗口內(nèi)選擇性地消除長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)，研究人員發(fā)現(xiàn)突觸可塑性的不同階段發(fā)揮著不同的作用。第一階段，在海馬中起局部作用，賦予背景特異性。第二階段，在同一天的睡眠中，將這些神經(jīng)元組織成同步放電的集合。最后，第二天睡眠時(shí)前扣帶皮層的LTP需要進(jìn)一步穩(wěn)定記憶。這表明了構(gòu)成記憶鞏固早期階段的可塑性事件的精確定位、時(shí)間和特征貢獻(xiàn)。

正文

目前對(duì)場(chǎng)景記憶的普遍觀點(diǎn)是，它最初編碼在海馬中，隨后轉(zhuǎn)移到其他區(qū)域，包括大腦皮層，長(zhǎng)期存儲(chǔ)過(guò)程稱為記憶鞏固。有人提出，突觸可塑性可能是學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)，學(xué)習(xí)被認(rèn)為在記憶鞏固中起著關(guān)鍵作用。然而，突觸可塑性在何時(shí)何地發(fā)生，而更復(fù)雜的問(wèn)題是突觸可塑性如何形成神經(jīng)元表征。這主要是由于缺乏適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)檢測(cè)和修改突觸可塑性。因此，研究人員應(yīng)用Inscopix自由活動(dòng)鈣成像顯微技術(shù)和光遺傳學(xué)方法，選擇性地消除長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)，而不影響基礎(chǔ)傳遞或排除未來(lái)的可塑性事件。

1. sLTP的光擦除
研究人員使用基因編碼的光敏劑蛋白SuperNova(SN)，它允許活細(xì)胞中特定分子的發(fā)色基團(tuán)輔助光失活(CALI)。在特定波長(zhǎng)的光照下，SN產(chǎn)生活性氧，使其融合的蛋白質(zhì)失活。在表達(dá)CFL與SN融合蛋白(CFL-SN)的非神經(jīng)元細(xì)胞中，光照誘導(dǎo)CALI抑制了微孔板的肌動(dòng)蛋白依賴的運(yùn)動(dòng)，這與CFL的失活一致。在海馬切片培養(yǎng)的CFL-綠色熒光蛋白(GFP)與CA1錐體神經(jīng)元中共表達(dá)，并以DsRed2作為填充物。在單樹突棘上MNI（4-甲氧基-7-硝基氨基）谷氨酸雙光子誘導(dǎo)sLTP后，觀察到CFL-GFP的快速積累，超過(guò)了體積的增加(圖1A、B)。通過(guò)在sLTP誘導(dǎo)后10分鐘誘導(dǎo)CALI，CFL-GFP的富集和樹突棘體積的增加均被逆轉(zhuǎn)。

使用光活性GFP(PAGFP)融合肌動(dòng)蛋白測(cè)試CFL-SN的CALI是否可以恢復(fù)肌動(dòng)蛋白周轉(zhuǎn)。在樹突棘頂端的PAGFP-actin的光激活顯示了樹突棘內(nèi)的肌動(dòng)蛋白周轉(zhuǎn)，這在sLTP誘導(dǎo)后減慢(圖1C)。然而，當(dāng)sLTP誘導(dǎo)后進(jìn)行CALI時(shí)，肌動(dòng)蛋白周轉(zhuǎn)恢復(fù)，脊柱體積恢復(fù)到基線水平�？偟膩�(lái)說(shuō)，這些結(jié)果與共絲狀蛋白結(jié)構(gòu)維持了sLTP誘導(dǎo)后樹突棘體積的增加，以及CFL-SN的CALI可以通過(guò)破壞該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和恢復(fù)肌動(dòng)蛋白的周轉(zhuǎn)來(lái)有效地逆轉(zhuǎn)sLTP的觀點(diǎn)相一致。
 

圖1

2.sLTP光擦除的時(shí)間窗
與表達(dá)未融合SN的樹突棘相比，表達(dá)了CFL-SN的樹突棘在LTP后10分鐘的光照導(dǎo)致樹突棘增大減少(圖1D、E)。同樣，sLTP誘導(dǎo)30分鐘后，CALI仍能有效地減少樹突棘體積。然而，這種效應(yīng)在50分鐘后并不明顯(圖1F)。CALI在sLTP前1分鐘作用于樹突棘,對(duì)其隨后的表達(dá)沒(méi)有影響(圖1F)。此外，CALI在未誘導(dǎo)sLTP的樹突棘中觸發(fā)，對(duì)樹突棘體積沒(méi)有影響，無(wú)論其原始大小如何(圖1D、E)。CALI后在同一樹突棘仍有可能再誘導(dǎo)sLTP，這表明該過(guò)程不會(huì)造成永久性損傷，而只是暫時(shí)破壞了樹突棘相關(guān)的可塑性機(jī)制(圖1E).

3. 電生理記錄的LTP也可以被光擦除
為了檢測(cè)CFL-SN的CALI是否能消除電記錄的LTP，研究人員在CaMKIIa-Cre小鼠海馬切片CA1層放射層記錄了場(chǎng)興奮性突觸后電位(field excitatory post-synaptic potentials, fEPSPs)。高頻刺激(HFS)誘導(dǎo)LTP，10min后觸發(fā)CALI。在LTP途徑中fEPSPs特異性降低，而在控制途徑或表達(dá)未融合SN的切片中則沒(méi)有。隨后的HFS產(chǎn)生了fEPSPs的持續(xù)增強(qiáng)，表明CALI選擇性地擦除了現(xiàn)有的LTP，而不干擾任何未來(lái)的可塑性事件。CALI在LTP誘導(dǎo)前1分鐘或LTP誘導(dǎo)后50分鐘進(jìn)行時(shí)，對(duì)電位沒(méi)有任何影響。由于n-甲基-d-天冬氨酸受體和代謝性谷氨酸受體依賴的長(zhǎng)時(shí)程抑制(LTD)都將CFL作為共同的下游介質(zhì)，因此有必要研究CALI對(duì)LTD的影響。然而，沒(méi)有觀察到對(duì)低頻刺激誘導(dǎo)的LTD的影響。

4. 光擦除LTP會(huì)在特定時(shí)間窗口內(nèi)損害特定于場(chǎng)景的記憶
研究人員測(cè)試了是否能夠抹去完好動(dòng)物的記憶。CaMKIIa-Cre小鼠通過(guò)注射AAV2-EF1a-DIO-CFL-SN，在海馬CA1背側(cè)雙側(cè)表達(dá)CFL-SN，并在注射區(qū)域上方植入光纖(圖2A)。使用抑制性躲避(IA)學(xué)習(xí)訓(xùn)練評(píng)估記憶。在這項(xiàng)任務(wù)中，小鼠被放置在一個(gè)有燈光的隔間里。它們通常在門打開后30秒內(nèi)轉(zhuǎn)移到黑暗的一面，在那里它們受到足部電擊(圖2B)。盡管小鼠(沒(méi)有注射病毒或光照)在第2天向黑暗方向交叉潛伏期延長(zhǎng)，但表達(dá)CFL-SN的小鼠在足部電擊后2分鐘經(jīng)歷CALI后，交叉潛伏期明顯縮短，表明記憶形成被破壞(圖2C)。在沒(méi)有CALI的情況下，同樣的小鼠在第2天受到電擊，并在第3天進(jìn)行測(cè)試后，能夠形成記憶，排除了任何對(duì)神經(jīng)元功能的非特異性干擾。表達(dá)CFL-GFP或未融合SN的動(dòng)物即使在有光照的情況下也能正常形成記憶。同樣，在沒(méi)有光照的情況下表達(dá)CFL-SN的動(dòng)物也形成了強(qiáng)健的記憶，排除了CFL-SN的過(guò)表達(dá)有助于觀察到的效果的可能性。

CALI在電擊后的不同時(shí)間點(diǎn)被觸發(fā)。當(dāng)在足部電擊后20分鐘內(nèi)進(jìn)行CALI時(shí)，記憶明顯受損(圖2D)。然而，無(wú)論是在動(dòng)物被放置在IA室前1分鐘還是電擊后1小時(shí)，光線都不會(huì)影響動(dòng)物的記憶。

為了測(cè)試受損記憶的場(chǎng)景特異性，研究準(zhǔn)備了兩個(gè)在大小、地板紋理、視覺線索、照明顏色和氣味方面不同的IA場(chǎng)景(圖2E)。小鼠首先在沒(méi)有CALI的環(huán)境下接受訓(xùn)練。兩小時(shí)后，小鼠被放置在場(chǎng)景B中，在那里它們顯示出短的交叉延遲，表明它們能夠充分區(qū)分場(chǎng)景B和場(chǎng)景A(圖2E)。交叉后，小鼠被電擊，隨后進(jìn)行CALI。第二天，當(dāng)回到場(chǎng)景B時(shí)，經(jīng)歷CALI的小鼠顯示出更短的交叉潛伏期，表明場(chǎng)景B的記憶被抹去了。然而，當(dāng)放置在場(chǎng)景A中時(shí)，同樣的小鼠有交叉潛伏期，類似于那些沒(méi)有接受CALI的對(duì)照組小鼠，這表明場(chǎng)景特定記憶可以選擇性地受損。
 

圖2 CALI光擦除記憶

5. 睡眠時(shí)LTP的光擦除也會(huì)損害記憶
當(dāng)動(dòng)物處于靜止或睡眠狀態(tài)時(shí)，與記憶形成相關(guān)的海馬神經(jīng)元活動(dòng)模式會(huì)被離線回放，這一過(guò)程被認(rèn)為是記憶鞏固的基礎(chǔ)。為了確定學(xué)習(xí)后的長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，是否會(huì)在海馬局部誘導(dǎo)記憶鞏固(offline LTP)，在小鼠回籠后每20分鐘照海馬(CFL-SN系統(tǒng)的時(shí)間分辨率)，從電擊后2小時(shí)開始，持續(xù)8小時(shí)。發(fā)現(xiàn)記憶被完全抹去(圖3A)。當(dāng)同樣一組小鼠在第2天受到電擊，并在第3天進(jìn)行測(cè)試時(shí)，這些動(dòng)物表現(xiàn)出了正常的記憶力，排除了非特異性組織損傷。為了進(jìn)一步縮小LTP的時(shí)間窗口，在第一個(gè)或第二個(gè)4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行光照。記憶仍然被抹去。由于局部海馬LTP在電擊后8小時(shí)內(nèi)仍對(duì)居住籠內(nèi)的記憶形成起作用，接下來(lái)測(cè)試offline LTP是否會(huì)持續(xù)數(shù)天。只在第2天對(duì)海馬進(jìn)行了照射，但沒(méi)有觀察到記憶退化(圖3B)，這表明offline LTP在學(xué)習(xí)后延長(zhǎng)超過(guò)2小時(shí)，但鞏固僅限于海馬局部的一天。

海馬在清醒狀態(tài)和睡眠狀態(tài)下都有回放，并且有研究表明這些狀態(tài)下的事件可能扮演不同的角色。我們分析了這些進(jìn)程相對(duì)于記憶整合進(jìn)程的狀態(tài)依賴貢獻(xiàn)。在線分析腦電圖(EEG)和肌電圖(EMG)數(shù)據(jù)，自動(dòng)確定動(dòng)物的行為狀態(tài)，CALI分別在清醒或睡眠至少20分鐘時(shí)觸發(fā)(圖3C)。當(dāng)在睡眠期間進(jìn)行CALI時(shí)，記憶受損(圖3D)。然而，在清醒時(shí)，沒(méi)有明顯的影響。此外，當(dāng)CALI在睡眠期間進(jìn)行，但僅在第二天，它不再損害記憶形成(圖3D)。
 

圖3 睡眠時(shí)LTP的光擦除也會(huì)損害記憶

6. online和offline LTP對(duì)海馬表征形成的不同作用
兩種形式的海馬LTP是記憶形成所必需的：線上LTP發(fā)生在事件期間或之后，以及線下LTP發(fā)生在隨后的睡眠期間。使用Inscopix自由活動(dòng)鈣成像顯微鏡成像自由行為的小鼠海馬興奮性神經(jīng)元的反應(yīng)，確定這兩種LTP形式是否對(duì)海馬表征有不同的影響。將AAV9-CAG-DIO-CFL-SN-P2A-GCaMP6f注射到CaMKIIa-Cre小鼠海馬背側(cè)，然后將GRIN透鏡植入注射部位上方(圖4A)。第1天，在沒(méi)有電擊的情況下，記錄小鼠暴露于IA室的神經(jīng)元活動(dòng)(圖4B)。第2天，小鼠再次暴露在相同的房間中，進(jìn)入黑暗的一面后受到電擊。在一組小鼠中，在電擊后2分鐘，光線通過(guò)透鏡照射來(lái)消除線上LTP(online CALI組)。為了限制對(duì)局部環(huán)路的影響，在成像側(cè)單方面誘導(dǎo)CALI。在第二組中，每20分鐘照明一次(在IA測(cè)試后2小時(shí)開始照明，共8小時(shí))，以消除線下LTP(offline CALI組)，而對(duì)照組受到電擊，但不接受照明(shock noCALI組)。第3天，三組小鼠再次暴露于IA試驗(yàn)室內(nèi)，記錄神經(jīng)元活動(dòng)。通過(guò)定義每個(gè)細(xì)胞的選擇性評(píng)分，比較了習(xí)慣室和IA測(cè)試室中單個(gè)神經(jīng)元的放電情況(圖4C至E)。

圖4.1 海馬體的LTP過(guò)程在記憶形成和記憶鞏固中具有重要作用

在第1天和第2天，未接受電擊的動(dòng)物的CA1神經(jīng)元與習(xí)慣室相比，在相似水平上對(duì)測(cè)試室表現(xiàn)出適度的選擇性(圖4D)。相比之下,在動(dòng)物被電擊(shock noCALI組)，與第一天相比，第三天在習(xí)慣室中的神經(jīng)元明顯更活躍，從而導(dǎo)致整體選擇性增加(圖4C、E)。在電擊后兩分鐘后擦除線上LTP(shock+online CALI組)，沒(méi)有出現(xiàn)選擇性增加。相比之下，擦除線下LTP并沒(méi)有削弱增加的選擇性(shock+offline CALI組)。

為了分析線下LTP對(duì)海馬突觸環(huán)路的影響，研究人員使用主成分分析方法(PCA)分析群體Ca2+動(dòng)力學(xué)(圖4F)。在只使用電擊的小鼠中，在IA學(xué)習(xí)后，觀察到活動(dòng)反復(fù)偏離第1天的軌跡。在觀察到這些偏差的時(shí)間點(diǎn)，Ca2+信號(hào)在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間共享的多個(gè)細(xì)胞中增加(圖4G)，表明它們反映了特定神經(jīng)元組的重復(fù)同步活動(dòng)。同步事件主要發(fā)生在觀測(cè)到偏差的時(shí)候，而同步事件的數(shù)量在電擊后增加，盡管平均發(fā)射率在第1天和第3天之間沒(méi)有變化(圖4H)。當(dāng)線上LTP或線下LTP被刪除時(shí)，PCA的偏差以及同步事件的增加都不明顯(圖4F和H)，這表明了學(xué)習(xí)后兩種形式的LTP對(duì)同步活動(dòng)的重要性。在第3天，開門前在室中心周圍廣泛觀察到同步發(fā)放，而開門后，門附近的同步發(fā)放最為明顯(圖4I)。這表明，這種群體活動(dòng)可能反映了對(duì)訓(xùn)練事件的回憶。然后，使用PCA分析將noCALI組的神經(jīng)元根據(jù)它們參與同步事件的程度分為兩類，然后分別計(jì)算選擇性得分(圖4J)。參與同步活動(dòng)至少一次的細(xì)胞在學(xué)習(xí)后(第3天)比學(xué)習(xí)前(第1天)表現(xiàn)出更高的選擇性得分，盡管那些沒(méi)有參與學(xué)習(xí)的細(xì)胞表現(xiàn)出選擇性得分被學(xué)習(xí)調(diào)節(jié)的程度顯著降低。然后，根據(jù)電擊前后選擇性評(píng)分的變化將細(xì)胞分為兩組(圖4K)。在noCALI動(dòng)物中，電擊后選擇性評(píng)分增加的細(xì)胞比電擊后選擇性評(píng)分減少的細(xì)胞更有可能參與同步活動(dòng)。在線下CALI動(dòng)物中，參與同步活動(dòng)的細(xì)胞比例總體上低于noCALI動(dòng)物，并且在電擊后選擇性得分增加的細(xì)胞和那些顯示選擇性得分減少的細(xì)胞之間是相似的。這些結(jié)果表明，選擇性得分和同步活動(dòng)之間存在因果關(guān)系，而且可以被線下CALI消除。
 

圖4.2 海馬線上LTP和線下LTP在記憶印記形成中有不同的作用

7. 在第二天睡眠時(shí)清除ACC中的LTP會(huì)損害記憶
為了更進(jìn)一步探究記憶的轉(zhuǎn)移（海馬-皮層），研究人員選擇利用CALI抑制前扣帶皮層（ACC）的神經(jīng)元突觸可塑性，注意到在小鼠訓(xùn)練后的第二天給光照可以非常有效的擦除記憶，也就是說(shuō)記憶在學(xué)習(xí)的第二天就通過(guò)建立皮層神經(jīng)元中的LTP從海馬轉(zhuǎn)移到皮層了（圖5）。

圖5 ACC具有與海馬不同的LET時(shí)間窗

結(jié)論
研究人員提供了清晰的證據(jù)，表明記憶形成、鞏固的早期階段由突觸可塑性的多個(gè)步驟組成。本研究中開發(fā)出了一個(gè)簡(jiǎn)單的多功能光遺傳技術(shù)，通過(guò)有選擇性（時(shí)間和空間）的擦除建立起的LTP非常有效地操控記憶的形成、鞏固及調(diào)用，更全面的剖析了突觸可塑性事件跨越多個(gè)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和群體，提供了更清晰的記憶鞏固圖像。通過(guò)結(jié)合Inscopix自由活動(dòng)鈣成像顯微方法，能夠識(shí)別在記憶鞏固過(guò)程中經(jīng)歷突觸可塑性的神經(jīng)信號(hào)。這為未來(lái)對(duì)學(xué)習(xí)記憶的研究提供了一個(gè)強(qiáng)有力的技術(shù)手段，并且讓我們對(duì)記憶的認(rèn)識(shí)又先前邁出了重要的一步。

該研究的通訊作者 Yasunori Hayashi 表示：“這項(xiàng)新技術(shù)提供了一種方法，可以在細(xì)胞水平上分離大腦中時(shí)間和空間上的記憶形成。希望這種方法能帶來(lái)一系列精神障礙的治療方法，如阿爾茨海默病、學(xué)習(xí)障礙和精神分裂癥等等。”

參考文獻(xiàn):
1.Akihiro Goto, Ayaka Bota, Ken Miya, Jingbo Wang, Suzune Tsukamoto, Xinzhi Jiang, Daichi Hirai, Masanori Murayama, Tomoki Matsuda, Thomas J. McHugh, Takeharu Nagai, Yasunori Hayashi. Stepwise synaptic plasticity events drive the early phase of memory consolidation. Science, 2021; 374 (6569): 857 DOI: 10.1126/science.abj9195

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