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利用iQue流式進(jìn)行高通量小分子藥物研發(fā)

瀏覽次數(shù):1231 發(fā)布日期:2022-3-28  來(lái)源:賽多利斯
盡管制藥技術(shù)已經(jīng)擴(kuò)展到細(xì)胞療法、基因療法、RNA干擾(RNAi)、CRISPR等新型模式,小分子藥物仍然是新藥研發(fā)的一大支柱,除了備受關(guān)注的“不可成藥”靶點(diǎn)的小分子配體研究,基于表型的藥物篩選也隨著日益復(fù)雜的細(xì)胞模型的建立而復(fù)興。提高表型篩選的通量及效率成為加速小分子藥物研發(fā)的重中之重。

表型篩選瓶頸

常用的高內(nèi)涵成像或免標(biāo)記篩選方法對(duì)于溶液中細(xì)胞或者磁珠的檢測(cè)顯得“力不從心”。另外,針對(duì)分泌蛋白(包括趨化因子和細(xì)胞因子)的多重檢測(cè)也難以滿(mǎn)足所需的高通量和便捷度。

iQue® 高通量流式細(xì)胞儀通過(guò)高通量懸浮細(xì)胞篩選填補(bǔ)了這一空白。具備多通道、多參數(shù)的特點(diǎn),可以快速、輕松地篩選 96、384或 1536 孔板的大型文庫(kù)。通過(guò)ForeCyt®高通量分析軟件自動(dòng)生成豐富、海量的數(shù)據(jù)集,快速確定化合物的優(yōu)先級(jí),加快推進(jìn)藥物發(fā)現(xiàn)流程。下面通過(guò)5大應(yīng)用,一覽iQue®在小分子藥物研發(fā)中的風(fēng)采吧!


小分子藥物發(fā)現(xiàn)

1    急性髓系白血病治療藥物開(kāi)發(fā)

盡管60%-70%的急性髓系白血。ˋML)患者在接受標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)治療后病情得到緩解,但大多數(shù)患者會(huì)在三年內(nèi)復(fù)發(fā),五年的總生存率只有27%。因此,尋找新的AML治療策略是一種亟待滿(mǎn)足的醫(yī)療需求。近期的三項(xiàng)研究中都將iQue®整合到AML潛在治療藥物篩選的工作流程中。

蒙特利爾大學(xué)免疫學(xué)和癌癥研究所(IRIC)的科研人員發(fā)現(xiàn)Mubritinib(一種ERBB2抑制劑)具有很強(qiáng)的在體外和體內(nèi)抗AML的活性,可通過(guò)抑制泛醌依賴(lài)性電子傳遞鏈(ETC)復(fù)合物I的活性而發(fā)揮作用[1]。赫爾辛基大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究院的科研人員通過(guò)iQue®,同時(shí)對(duì)34個(gè)原始AML樣本中不同細(xì)胞群對(duì)7種藥物,及27種組合劑量的體外敏感度進(jìn)行了評(píng)估(圖1-1)。結(jié)果表明,AML樣本中的不同細(xì)胞群對(duì)靶向治療藥物的敏感度存在差異 [2]。

圖1-1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)置簡(jiǎn)要流程示意圖


隨后,他們使用iQue®建立了一種高通量流式細(xì)胞術(shù),同時(shí)監(jiān)測(cè)71種抗腫瘤化合物對(duì)多個(gè)造血細(xì)胞群(表面抗原表達(dá))的劑量反應(yīng)。通過(guò)對(duì)比健康細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞(來(lái)自AML、多發(fā)性骨髓瘤或慢性淋巴細(xì)胞白血病患者)的藥物反應(yīng),發(fā)現(xiàn)健康細(xì)胞反應(yīng)能夠預(yù)測(cè)出相應(yīng)惡性細(xì)胞的反應(yīng)(圖1-2)[3]。

圖1-2. iQue®在造血細(xì)胞免疫表型分析中的應(yīng)用及門(mén)控策略。使用7-AAD和Annexin-V分別對(duì)單核細(xì)胞的死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞進(jìn)行排除。根據(jù)其核心表面抗原的表達(dá),檢測(cè)11個(gè)細(xì)胞亞群(造血干細(xì)胞(HSC/CD34+CD38-),普通祖細(xì)胞(CPC/CD34+CD38+)。

2    小分子化合物庫(kù)篩選

FOXP3+ Treg細(xì)胞在控制癌癥免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用,但是作為T(mén)reg細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)因子,F(xiàn)OXP3在誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞中的表達(dá)并不穩(wěn)定,F(xiàn)OXP3的調(diào)控表達(dá)及Treg細(xì)胞功能的分子靶點(diǎn)也尚不明確。而能夠調(diào)節(jié)FOXP3表達(dá)及其下游基因(如CTLA4)的藥物靶點(diǎn)具有穩(wěn)定Treg表型及功能的潛力。來(lái)自阿斯利康IMED生物技術(shù)部門(mén)的研究人員使用iQue®開(kāi)發(fā)了一種自動(dòng)化384孔板的高通量流式細(xì)胞術(shù)表型實(shí)驗(yàn),可用于測(cè)定人類(lèi)Treg細(xì)胞中FOXP3和CTLA4的蛋白表達(dá)[4](圖2)。
 

圖2. 使用iQue®進(jìn)行人類(lèi)Treg細(xì)胞擴(kuò)增、表征和表型篩選。(A)擴(kuò)增的Treg細(xì)胞表達(dá)高水平的FOXP3和CTLA4;(B) 擴(kuò)增的Treg細(xì)胞缺乏IL-2的產(chǎn)生;(C, D) 導(dǎo)致FOXP3 MFI增加或減少(C)和導(dǎo)致CTLA4 MFI增加(D)的代表性化合物的柱狀圖;(E)人類(lèi)Treg細(xì)胞表型篩選簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)流程,包括Treg細(xì)胞的分離、擴(kuò)增、小分子化合物處理以及細(xì)胞活力、FOXP3和CTLA4表達(dá)。

3    蛋白激酶抑制劑化合物庫(kù)篩選

北卡羅來(lái)納大學(xué)藥理學(xué)院的研究人員使用iQue®篩選出了一個(gè)包含800多種蛋白激酶抑制劑的化合物庫(kù),并確定了可在KRAS突變型胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)細(xì)胞系中促進(jìn)MYC癌蛋白穩(wěn)定或降解的化合物[5](圖3)。由于KRAS信號(hào)使MYC變得穩(wěn)定,進(jìn)而促進(jìn)PDAC的生長(zhǎng),因此深入了解這種穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)方式將有助于開(kāi)發(fā)出治療極具挑戰(zhàn)性癌癥的療法。

圖3. MYC降解篩選優(yōu)化。(A)GPS-MYC篩選示意圖。(B)GPS-MYC細(xì)胞用vehicle(DMSO)單一處理,或用MG132或CHX處理6小時(shí),并在iQue®上進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)來(lái)自于每個(gè)對(duì)照組的前兩孔和后兩孔,分別代表實(shí)驗(yàn)開(kāi)始(0分鐘)和結(jié)束(45分鐘)。(C) GPS-MYC篩查是一式兩份的。數(shù)據(jù)與對(duì)照組DMSO(藍(lán)色圓圈,0%穩(wěn)定)和MG132(綠色圓圈,100%穩(wěn)定)進(jìn)行歸一化處理,并以?xún)蓚(gè)重復(fù)的30%平均穩(wěn)定率為界確定命中率。代表命中的圓圈以紫色顯示。圓圈的大小與每孔的事件數(shù)成正比。評(píng)估出的穩(wěn)定化化合物在圖中標(biāo)出。(D) 與(C)相同,除了對(duì)照組為DMSO(藍(lán)色圓圈,0%失穩(wěn))和CHX(紅色圓圈,100%失穩(wěn))。評(píng)估出的不穩(wěn)定化合物被標(biāo)出。

4   揭示小分子BH3模擬物抗癌機(jī)制

抑制癌細(xì)胞的抗凋亡機(jī)制也是一種極具前景的治療方法。小分子BH3模擬物能夠模擬BH3蛋白,抑制抗凋亡蛋白促細(xì)胞生存的功能,從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。要成為真正的BH3模擬物,就必須滿(mǎn)足2個(gè)標(biāo)準(zhǔn):

  1. 需要直接在已知抗凋亡依賴(lài)性細(xì)胞的線(xiàn)粒體上發(fā)揮作用;

  2. 直接且選擇性抑制具有高親和力的抗凋亡蛋白。

來(lái)自美國(guó)丹娜法伯腫瘤醫(yī)院的科研人員開(kāi)發(fā)了一套能夠綜合分析BH3模擬候選物,并進(jìn)行高通量活性測(cè)試的方法。iQue®在此方法主要用于進(jìn)行活性測(cè)試[6]
 

5   確定去鐵酮(DFP)的抗增殖機(jī)制

近期,佐治亞理工學(xué)院的一項(xiàng)研究中使用iQue®確定去鐵酮(DFP)的抗增殖機(jī)制[7]。DFP是2011年由FDA批準(zhǔn)在美國(guó)上市的一種可口服的鐵螯合劑,與鐵具有良好的親和力,可有效地控制體內(nèi)鐵負(fù)荷。研究人員發(fā)現(xiàn),DFP的抗增殖活性主要來(lái)自其對(duì)鐵依賴(lài)組蛋白賴(lài)氨酸脫甲基酶(KDM)亞群的抑制。他們還發(fā)現(xiàn)了基于DFP的新型KDM抑制劑,該抑制劑對(duì)癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性更強(qiáng)。在小鼠異種移植模型中,僅一種先導(dǎo)化合物就能有效抑制乳腺腫瘤的生長(zhǎng)。在該研究中,所有基于流式細(xì)胞術(shù)的測(cè)試均由iQue®完成。

為什么iQue®在小分子藥物開(kāi)發(fā)中被廣泛認(rèn)可?
 

  • 更快的高通量篩選:96孔板分析僅需5分鐘,384孔板分析僅需20分鐘;
  • 節(jié)約成本,加快研發(fā)速度:每個(gè)孔中采樣 1 µL,節(jié)省了試劑成本,保存了有限的樣本;
  • 為懸浮細(xì)胞的高通量篩選賦能:對(duì)免疫調(diào)節(jié)劑或復(fù)雜的混合細(xì)胞(如 PBMC)的分析進(jìn)行優(yōu)化,并以單細(xì)胞的分辨率生成每種細(xì)胞類(lèi)型的數(shù)據(jù);
  • 智能的數(shù)據(jù)分析處理:ForeCyt®軟件是基于微孔板整板分析的大型數(shù)據(jù)集,包括內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和獨(dú)特功能(如 Profile Map)的數(shù)據(jù)分析和可視化工具,數(shù)據(jù)可輕松導(dǎo)出到您的電子實(shí)驗(yàn)室筆記本系統(tǒng)
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-參考文獻(xiàn)-
  1. Baccelli I, Gareau Y, Lehnertz B, et al. Mubritinib as a strong in vitro and in vivo anti-leukemic compound, acting through ubiquinone-dependent inhibition of electron transport chain complex I (ETC1). http://dx.doi. org/10.1101/513887

  2. Kuusanmäki H, Leppä A-M, Pölönen P, et al. Phenotypebased drug screening reveals association between venetoclax response and differentiation stage in acute myeloid leukemia. Haematologica. 2020:105(3):708-720. doi: 10.3324/haematol.2018.214882.

  3. ntasir MM, Leppä A-M, Hellesoy M, et al. Multiparametric single cell evaluation defines distinct drug responses in healthy hematological cells that are retained in corresponding malignant cell types. Haematologica. 2020;105(6):1527-1538. doi:10.3324/haematol.2019.217414.

  4. Ding M, Brengdahl J, Lindqvist M, et al. A Phenotypic Screening Approach Using Human Treg Cells Identified Regulators of Forkhead Box p3 Expression. ACS Chem Biol. 2019;14(3):543-553. doi: 10.1021/acschembio.9b00075. Epub 2019 Mar 4. PMID: 30807094

  5. Blake, DR, Vaseva AV, Hodge RG, et al. Application of a MYC degradation screen identifies sensitivity to CDK9 inhibitors in KRAS-mutant pancreatic cancer. Sci Signal. 2019;12(590):eaav7259. Doi: 10.1126/scisignal.aav7259.

  6. Villalobos-Ortiz M, Ryan J, Mashaka TN, et al. BH3 profiling discriminates on-target small molecule BH3 mimetics from putative mimetics. Cell Death Differ. 2020;27(3):999-1007. doi:10.1038/s41418-019-0391-9.

  7. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, et al. Deferiprone: pan-selective histone lysine demethylase inhibition activity and structure activity relationship study. Sci Rep. 2019;9(1):4802. doi:10.1038/s41598-019-39214-1.

來(lái)源:德國(guó)賽多利斯集團(tuán)
聯(lián)系電話(huà):實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品與服務(wù)事業(yè)部:400 920 9889 / 生物工藝解決方案事業(yè)部:400 680 1870
E-mail:info.cn@sartorius.com

標(biāo)簽: 高通量 流式細(xì)胞
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