相較于傳統(tǒng)3D技術(shù)方法，基于4D平臺(tái)的蛋白質(zhì)組學(xué)無論是在鑒定深度還是準(zhǔn)確性上都能帶來全面的提升。關(guān)于4D蛋白質(zhì)組學(xué)，小編在上期- 關(guān)于4D蛋白質(zhì)組學(xué)，你想知道的那些事兒（一）為大家?guī)�來了關(guān)于4D-shot gun的Q&A，今天一起來看看對(duì)于4D-Label free又有哪些常見問題吧。

篇章二 
4D-Label free：不需要對(duì)樣品進(jìn)行任何標(biāo)記，每個(gè)樣品可單獨(dú)上機(jī)。利用DDA采集模式分析直接酶解后的蛋白肽段，獲得蛋白質(zhì)表達(dá)量變化情況，對(duì)蛋白進(jìn)行定性定量分析。


同步累積連續(xù)碎裂（PASEF®）示意圖。timsTOF Pro質(zhì)譜儀的PASEF策略，離子在第一個(gè)TIMS分析器中進(jìn)行累積和聚焦，同時(shí)第二個(gè)TIMS分析器對(duì)肽段進(jìn)行淌度分離和逐步釋放。
圖片來源：BRUKER


Q1：為什么叫做Label free？
A：提到Label free就不得不提到iTRAQ和TMT，iTRAQ和TMT分別是由Thermo Fisher和AB SCIEX研發(fā)的多肽體外標(biāo)記定量技術(shù)，也是運(yùn)用廣泛的兩種標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)，具有相似的原理，兩者主要區(qū)別在于：TMT最高可同時(shí)標(biāo)記16組不同的生物樣品，iTRAQ最高可同時(shí)標(biāo)記8組不同的生物樣品。

與上述兩種多肽體外標(biāo)記定量技術(shù)不同，Label free無需使用昂貴的穩(wěn)定同位素標(biāo)簽做內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)樣品單獨(dú)上機(jī)，只需分析大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)時(shí)所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，比較不同樣品中相應(yīng)肽段的信號(hào)強(qiáng)度，從而對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量。其優(yōu)勢(shì)是無需依賴同位素標(biāo)記，每例單獨(dú)檢測(cè)，因此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活，適合臨床大幾十例、上百例樣本的檢測(cè)，同時(shí)也能看到樣本中的“有還是無”的蛋白。缺點(diǎn)是對(duì)儀器的穩(wěn)定性、實(shí)驗(yàn)人員的操作等可能產(chǎn)生系統(tǒng)誤差的因素要求極高。

Q2：4D-Label free為什么更具優(yōu)勢(shì)？
A：Label free每條肽段的豐度（量）與其在MS1中的峰面積或信號(hào)強(qiáng)度成正比；而不同樣品的同一條肽段在LC上的保留時(shí)間（retention time, RT）是一致的，因此，可以通過對(duì)比MS圖譜，再整合到相應(yīng)蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)水平的定量分析。由于常規(guī)DDA模式的Label free是基于topN的方法挑選母離子進(jìn)行二級(jí)碎裂的，所以難免會(huì)損失一些豐度較低的信號(hào)。4D-Label free由于增加了第四個(gè)維度-離子淌度（mobility）作為額外的一個(gè)數(shù)據(jù)對(duì)齊參數(shù)顯著減少了missing value，提高定量的準(zhǔn)確性，因此定性和定量數(shù)據(jù)更穩(wěn)定。

      蛋白質(zhì)磷酸化修飾調(diào)節(jié)著蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)、定位、折疊以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的交互作用等。許多至關(guān)重要的生命進(jìn)程不僅由蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度控制，更重要的是被那些時(shí)空特異分布的翻譯后修飾控制。因此，除了對(duì)基因組所編碼的“裸”蛋白質(zhì)組的研究以外，更需要對(duì)經(jīng)過翻譯后修飾的蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)組的調(diào)控過程進(jìn)行深入的研究。由于磷酸化修飾會(huì)導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)的微變化，常規(guī)3D分析不能完全區(qū)分，所以離子淌度（mobility）的引入使得4D-label free磷酸化鑒定更具優(yōu)勢(shì)。


Q3：4D-Label free有哪些應(yīng)用研究案例？
A：案例一：In-depth proteomics and natural peptidomics analyses reveal antibacterial peptides in human endometrial fluid
摘要：2020年，西班牙巴斯克地區(qū)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)子宮內(nèi)膜液的蛋白質(zhì)和天然肽進(jìn)行了全面分析。使用高靈敏度的4D label free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了來自11個(gè)個(gè)體的樣品的蛋白質(zhì)含量。鑒定了4694種蛋白質(zhì)以及3899種天然存在的肽。實(shí)驗(yàn)結(jié)果大大擴(kuò)展了已知子宮內(nèi)膜液蛋白質(zhì)的目錄，并提供了關(guān)于這種子宮內(nèi)膜液中天然肽含量的大量新信息。

案例二：Quantitative Proteomic Analysis of Chikungunya Virus-Infected Aedes aegypti Reveals Proteome Modulations Indicative of Persistent Infection
摘要：蚊子傳播的奇昆古尼亞病毒（CHIKV）對(duì)全世界熱帶國(guó)家的人類健康構(gòu)成威脅。2020年美國(guó)密蘇里大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)利用高靈敏度的4D label free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)感染和未感染的CHIKV的埃及伊蚊樣本中鑒定出2647至3167種蛋白質(zhì)，揭示了蚊子體內(nèi)與CHIKV相互作用的生物途徑和新蛋白質(zhì)�？偟膩碚f，CHIKV感染引起蚊子蛋白質(zhì)組的微小變化，表明載體和病毒之間高度適應(yīng)，基本上以非致病關(guān)系共存。

案例三：In-depth proteomic analysis of Plasmodium berghei sporozoites using trapped ion mobility spectrometry with parallel accumulation-serial fragmentation
摘要：2021年法國(guó)索邦大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)利用高靈敏度的4D label free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，結(jié)合三種不同的子孢子純化方法，利用少量寄生蟲鑒定伯氏瘧原蟲子孢子的蛋白質(zhì)組。這項(xiàng)研究為伯氏瘧原蟲子孢子提供了一個(gè)參考蛋白質(zhì)組，確定了一組跨物種表達(dá)的核心蛋白質(zhì)，并說明了timsTOF PRO系統(tǒng)前所未有的靈敏度如何能夠從有限的樣本量進(jìn)行深度蛋白質(zhì)組分析。

案例四：Synergistically Bifunctional Paramagnetic Separation Enables Efficient Isolation of Urine Extracellular Vesicles and Downstream Phosphoproteomic Analysis
摘要：2021年，美國(guó)普渡大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)基于新優(yōu)化的分離方法——BiMBs方法，能夠高效地從尿液中分離出細(xì)胞外囊泡，該方法具有低污染、高回收率以及分離時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，結(jié)合高靈敏度的4D label free蛋白質(zhì)組和4D label free磷酸化蛋白質(zhì)組等新技術(shù)對(duì)前列腺癌患者和健康個(gè)體尿液外囊泡分析，找到一系列疾病相關(guān)的磷酸化蛋白質(zhì)，表明其在臨床研究中的巨大應(yīng)用潛力。

案例五：Ultrafast and Reproducible Proteomics from Small Amounts of Heart Tissue Enabled by Azo and timsTOF Pro
摘要：2021年美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種超快速自下而上的4D label free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)方法，該方法由Azo（偶氮,一種可光裂解的、與質(zhì)譜兼容的表面活性劑，可有效溶解蛋白質(zhì)并促進(jìn)快速胰蛋白酶消化）與Bruker timsTOF Pro相結(jié)合，通過捕獲離子遷移譜（TIMS）和肽的平行積累-串聯(lián)片段化（PASEF）實(shí)現(xiàn)更深的蛋白質(zhì)組覆蓋。應(yīng)用這種方法來分析復(fù)雜的人類心臟蛋白質(zhì)組，從少至1毫克的人類心臟組織中鑒定了近4000個(gè)蛋白質(zhì)組，具有高重現(xiàn)性。總的來說，作者預(yù)計(jì)這種由Azo和timsTOF Pro支持的超快速、穩(wěn)健和可重復(fù)的自下而上方法將普遍適用，并大大加快大規(guī)模定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的吞吐量。

SBC擁有行業(yè)內(nèi)高水平的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，配備timsTOF Pro質(zhì)譜儀和資深生信分析團(tuán)隊(duì)，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供專業(yè)的科研技術(shù)服務(wù)，助力蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展和創(chuàng)新應(yīng)用。