真核生物基因包含一系列外顯子和內含子，內含子必須在轉錄過程中被移除以便成熟的 mRNA 被翻譯成蛋白質，RNA 剪接則是這一過程中至關重要的一步。RNA 剪接包含兩類剪接事件。

組成型剪接 (constitutive splicing): RNA 剪接的一種基本方式，這種情況下每個轉錄單位只產(chǎn)生一種成熟的 mRNA。

選擇性剪接 (alternative splicing): 一個 pre-mRNA 可形成多種成熟的 mRNA。可變剪接與疾病密切相關，最近的研究就發(fā)現(xiàn) RNA 剪接在腫瘤細胞中發(fā)生頻率遠超過正常細胞，RNA 剪接過程及其調控可以促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展。


RNA 剪接是個高度受控的過程，除了剪接位點和剪接體還有很多剪接調控元件 (SRE) 參與了剪接調控。順式作用元件招募剪接因子，以促進或抑制附近剪接位點的識別。反式作用元件可以結合至 pre-mRNA 上，調控剪接體的組裝和剪接位點的識別。

有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中大量的 RNA 剪接可能產(chǎn)生腫瘤新抗原。Intron retention is a source of neoepitopes in cancer 一文表明：由不完全 RNA 剪接產(chǎn)生的內含子保留翻譯的多肽在腫瘤細胞系中可由人主要組織相容性復合物 I (MHC I) 呈現(xiàn)。然而，剪接衍生的多肽是否會引起內源性免疫應答仍是未知的。

Abdel-Wahab 等研究者在 Cell 的前沿研究“Pharmacologic modulation of RNA splicing enhances anti-tumor immunity” 解答了這一問題，他們證實了在 RNA 剪接調節(jié)藥物的干擾下，腫瘤細胞產(chǎn)生了新抗原，并且這些抗原通過 MHC I 作為新抗原表位呈現(xiàn)，從而激發(fā)抗腫瘤免疫。 RBM39 是一種 RNA 結合蛋白，參與轉錄協(xié)同調控和選擇性 RNA 剪接。研究人員使用 Indisulam (剪接因子 RBM39 的降解劑) 處理多種腫瘤細胞系后，發(fā)現(xiàn) RBM39 降解對腫瘤細胞的體外生長影響不大 (圖 2C)。但是，把這些 Indisulam 處理過腫瘤細胞移植到小鼠體內，腫瘤細胞的體內生長被顯著性抑制 (圖 2E)。

這種體外和體內生長的明顯差異并非是腫瘤細胞的自主效應。研究人員推測他們觀察到的現(xiàn)象與 RNA 剪接刺激了抗腫瘤免疫反應有關。


接下來研究者們驗證剪接調節(jié)是否通過藥物誘導的新抗原產(chǎn)生增強腫瘤免疫識別。

研究者們比較了載有藥物治療腫瘤裂解物的專業(yè)抗原提呈細胞 (APCs) 刺激 T 細胞的能力。MC38 細胞用 DMSO、indisulam 或 MS-023 處理，用于生成含有潛在免疫原性肽(MHC I 肽) 的裂解物。野生 C57BL/6 或 B2m 敲除小鼠來源的 BMDCs 被裂解物脈沖，與 CD45.1⁺ 脾 T 細胞孵育。與對照組相比，Indisulam 或 MS-023 處理的 BMDCs 更能促進 CD8⁺ T 細胞增殖 (圖 3C 和 3D)。在 B2m KO BMDCs 中沒有觀察到這種效果，這表明 MHC I 肽呈遞是必需的。
接下來，研究人員使用 B16-F10，MC38 和 LLC 腫瘤模型評估 Indisulam 和 PD1 抗體分別單獨給藥或聯(lián)合使用對腫瘤生長的作用。

Indisulam 和 PD1 抗體聯(lián)合使用可顯著降低 B16-F10 和 MC38 腫瘤的生長，并且其效果超過了兩種藥物單獨使用的效果 (圖 4C)。這說明 Indisulam 和 PD1 抗體聯(lián)合使用可以協(xié)同抑制腫瘤的生長。MS-023 和 PD1 抗體聯(lián)合使用也具有協(xié)同抑制 B16-F10 和 MC38 腫瘤的生長的作用 (圖 4D)。這說明，干擾 RNA 剪接和阻斷免疫檢查點共同促進了對腫瘤生長的抑制作用。
  研究人員用轉錄組測序技術 (RNA-seq) 分析結果表明，Indisulam 處理 B16-F10 細胞后，RNA 內含子保留的覆蓋度在細胞質部分十分明顯 (圖 5A)，并且這些 mRNA 可以被翻譯成潛在的新抗原 (圖 5B)。這些結果表明，剪接調節(jié)能夠誘導大量新抗原的表達，導致潛在的免疫抗原的產(chǎn)生。

研究人員還檢測了所有 8-14 個氨基酸長度的多肽序列以此來分析 RNA 剪接調節(jié)藥物處理后人和鼠腫瘤細胞系內新抗原的變化。

在人和小鼠細胞系中1763 種新抗原在兩個物種中都有 (圖 5C)。研究人員還純化分離了與 H-2K^b 和 H-2D^b (即 MHC-I 類分子) 結合的多肽 (圖 5D)，并創(chuàng)建了 RNA 亞型和蛋白質組數(shù)據(jù)庫 (圖 5E)。質譜檢測結果分別發(fā)現(xiàn)了 366 種 (H-2D^b) 和 518 種 (H-2K^b) 新抗原(即 MHC-I 類分子)僅存在于Indisulam 處理的樣本中 (圖 5F)。


研究人員使用候選肽對小鼠進行免疫，檢測引流淋巴結中 CD8⁺ T 細胞分泌 IFN-γ 以及殺死腫瘤細胞的能力 (圖 6A，6D)。發(fā)現(xiàn)根據(jù) RNA-seq 和質譜分析選取的 70 個候選肽中，有 30 個在小鼠中引發(fā) CD8⁺ T 細胞免疫反應 (圖 6B)。根據(jù) RNA-seq 和 MHC I 結合預測選取的 39 個候選肽中的 11 個 引發(fā) CD8⁺ T 細胞免疫反應 (圖 6C)。

這些數(shù)據(jù)表明 RNA 剪接調節(jié)觸發(fā)了特定的新抗原的產(chǎn)生，其水平足以驅動識別這些抗原的 CD8⁺ T 細胞的增殖。


總結：

當前研究最多的腫瘤抗原主要源于基因突變，而本研究確定了 RNA 剪接調節(jié)藥物可以誘導腫瘤細胞產(chǎn)生潛在的抗原，并證明了剪接衍生的新抗原會引起內源性抗腫瘤免疫應答，具有增強免疫檢查點抑制療效的效力。這表明 RNA 剪接調節(jié)可作為腫瘤抗原的潛在來源，具有應用于腫瘤免疫檢查點治療的潛力。
 

相關產(chǎn)品

Indisulam Indisulam (E 7070) 是一種具有抗癌活性的 RNA 剪接調節(jié)的藥物，通過募集 DCAF15 來誘導 RBM39 降解。

MS023 MS023 是一種人 I 型蛋白精氨酸甲基轉移酶 (PRMTs) 抑制劑。

Pladienolide B Pladienolide B 是一種癌細胞生長抑制劑，靶向剪接體的 SF3B1 亞基，通過抑制 pre-mRNA 剪接發(fā)揮抗腫瘤活性。

Herboxidiene Herboxidiene (GEX1A) 是鏈霉菌 (Streptomyces sp. A7847) 的一種強植物毒性聚酮，通過結合剪接體相關蛋白 (SAP) 155 來抑制 pre-mRNA 的剪接過程。

EPZ015666 EPZ015666 (GSK3235025) 是一具有口服活性的 PRMT5 抑制劑。

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參考文獻
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