賽業(yè)生物《每周一鼠》，每周更新，為大家講解一個小鼠模型的故事，希望對大家了解不同的小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是Calca基因敲除小鼠。

Calca基因
該基因通過對基因轉(zhuǎn)錄本的RNA選擇性剪接和非活性前體蛋白的切割，編碼肽激素降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）和卡他鈣素。降鈣素參與鈣的調(diào)節(jié)，并發(fā)揮調(diào)節(jié)磷代謝的作用。降鈣素基因相關(guān)肽具有血管擴張劑和抗菌肽的功能，卡他鈣素是一種降鈣肽。

CGRP廣泛表達于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，參與多種生理過程，包括外周血管舒張、煙堿乙酰膽堿受體（AChR）的合成、睪丸下降、痛覺感受、碳水化合物代謝、胃腸運動、神經(jīng)源性炎癥和胃酸分泌。
 

圖1. CALCA基因以組織特異性方式產(chǎn)生降鈣素和α-降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）^[1]

Calca基因敲除小鼠表型
Hoff等人通過同源重組的方式采用Neo取代Calca基因的2-5號外顯子，達到基因缺失的目的。^[2]
 

圖2. 創(chuàng)建Calca基因缺失的小鼠^[2]

1  鈣代謝
在純合Calca敲除（KO）和野生型（WT）小鼠之間，血清鈣、離子鈣、磷、完整甲狀旁腺激素（PTH）、甲狀腺素和1,25-二羥基維生素D3 （1,25-D3） 沒有差異。
 

表1. 雌性小鼠鈣代謝參數(shù)的基線生化分析[2]
 

采用 hPTH（人甲狀旁腺激素，0.5 μg/g 體重）處理KO和WT小鼠：KO小鼠 在注射hPTH2小時和4小時后，血清鈣和尿脫氧吡啶啉（DPD）濃度顯著增加，WT小鼠沒有明顯變化（圖3a）。實驗中血清降鈣素（CT） 的平行測量顯示W(wǎng)T小鼠血清CT顯著增加，而KO小鼠血清CT沒有升高（圖3b）。對此的一種合理解釋是，用PTH處理的WT小鼠中血清CT的升高阻止了破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收和隨后的血清鈣水平的升高。在注射hPTH前立即進行CT預(yù)處理，劑量為10至100 pg/g時，可抑制PTH介導(dǎo)的血清鈣濃度升高（圖3c），從而防止高鈣血癥反應(yīng)。
 

圖3. 甲狀旁腺激素刺激的骨吸收在KO小鼠中引起高鈣血癥，并被CT給藥阻斷[2]

2  骨的X線攝影和組織形態(tài)測定
椎體和脛骨通過X線攝影結(jié)果顯示：1個月和3個月大的雌性KO小鼠的骨密度高于同齡的雌性WT小鼠。組織學(xué)分析顯示，雌性KO小鼠在1個月和3個月時椎體骨小梁體積顯著增加，在3個月時脛骨近端骨小梁體積顯著增加（圖4a）。經(jīng)組織形態(tài)分析證實，KO雌性小鼠骨體積和骨小梁數(shù)量顯著增加（圖4b）。WT和KO小鼠的小梁厚度相同，而KO小鼠的小梁間距顯著降低。
 

圖4. Calca基因KO導(dǎo)致小鼠骨骼增加[2]

3  感染模型
13年的一項研究對 Calca敲除小鼠（KO）和WT小鼠進行肺炎鏈球菌或銅綠假單胞菌的感染，使用滴定濃度導(dǎo)致20-80%的WT小鼠死亡，從而可以檢測到KO相對于WT小鼠的生存增加或減少。感染肺炎鏈球菌的KO小鼠多數(shù)在第3天死亡，感染銅綠假單胞菌的小鼠多數(shù)在第2天死亡，少數(shù)在第4天死亡，總生存期為7天。在革蘭氏陽性（肺炎鏈球菌）感染下， WT小鼠的7天存活率為3/13 （23%），KO小鼠為3/14 （21.4%）。在革蘭氏陰性（銅綠假單胞菌）感染下， WT小鼠的7天存活率為2/10 （20%），KO小鼠為2/11 （18.2%）。在任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性肺炎感染中，WT小鼠和KO小鼠的存活率沒有顯著差異。
 

圖5. 野生型（WT）和Calca敲除（KO）小鼠對肺炎感染的反應(yīng)[3]

肺炎鏈球菌感染24小時后，WT小鼠血清降鈣素/降鈣素原（CT/PCT）免疫反應(yīng)增強2.1倍，但在KO小鼠中未檢測到。該研究還使用CT的標準放射免疫分析法對樣品進行了分析：WT小鼠基線時可檢測到血清 CT/PCT 免疫反應(yīng)性，在甲狀旁腺激素刺激后升高4.4 倍，在肺炎鏈球菌感染24小時后升高 2.6 倍，但在任何這些條件下的KO小鼠中都檢測不到血清CT/PCT免疫反應(yīng)。

圖6. 野生型（WT）和Calca敲除（KO）小鼠對肺炎感染的反應(yīng)[3]
 

以上數(shù)據(jù)說明：由于感染和炎癥期間非內(nèi)分泌PCT表達較低，KO小鼠不是測試PCT在敗血癥發(fā)病機制中作用的理想功能喪失模型。

研究表明Calca基因不是生殖所必需的，它的缺失與任何嚴重的發(fā)育缺陷無關(guān)，并且它似乎不會影響基礎(chǔ)鈣或其他礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)。然而，如果仔細觀察，就會發(fā)現(xiàn)CT在正常骨和礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)中的作用。缺陷小鼠對外源性PTH給藥的反應(yīng)性增強；進一步的分析表明，破骨細胞數(shù)量或骨吸收標志物 （DPD） 沒有差異，而骨形成率顯著增加。KO小鼠意外發(fā)現(xiàn)的骨形成增加表明Calca基因產(chǎn)物對骨形成調(diào)節(jié)的作用未被認識。鑒于受損的骨再生影響很大比例的骨折患者，在機械水平上了解骨折愈合并確定主要影響骨再生的介質(zhì)具有高度的臨床和科學(xué)重要性。鑒于CGRP受體與細胞表面結(jié)合，使其成為極好的藥物靶點，選擇性CGRP激動劑可能被證明是治療受損骨折愈合的潛在藥理學(xué)方法。^[4]

參考文獻：
(1) Raynaud A, Cohen R, Modigliani E. Le peptide alternatif du gène de la calcitonine （CGRP） [Calcitonin gene-related peptide （CGRP）]. Presse Med. 1994 Feb 5;23（4）:171-5. French. PMID: 8177860.

(2) Hoff AO, Catala-Lehnen P, Thomas PM, Priemel M, Rueger JM, Nasonkin I, Bradley A, Hughes MR, Ordonez N, Cote GJ, Amling M, Gagel RF. Increased bone mass is an unexpected phenotype associated with deletion of the calcitonin gene. J Clin Invest. 2002 Dec;110（12）:1849-57. doi: 10.1172/JCI14218. PMID: 12488435; PMCID: PMC151647.

(3) Tuvim MJ, Clement CG, Huang ES, Cote GJ, Evans SE, Lei X, Deftos LJ, Gagel RF, Dickey BF. Deletion of the gene encoding calcitonin and calcitonin gene-related peptide α does not affect the outcome of severe infection in mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2013 Jul;49（1）:151-5. doi: 10.1165/rcmb.2012-0489OC. PMID: 23526213; PMCID: PMC3727888.

(4) Appelt J, Baranowsky A, Jahn D, Yorgan T, Köhli P, Otto E, Farahani SK, Graef F, Fuchs M, Herrera A, Amling M, Schinke T, Frosch KH, Duda GN, Tsitsilonis S, Keller J. The neuropeptide calcitonin gene-related peptide alpha is essential for bone healing. EBioMedicine. 2020 Sep;59:102970. doi: 10.1016/j.ebiom.2020.102970. Epub 2020 Aug 24. PMID: 32853990; PMCID: PMC7452713.

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