什么是Cre-Lox系統(tǒng)
Cre-Lox基因重組系統(tǒng)是一種被廣泛應用于特異性基因敲除、基因易位、基因翻轉以及基因插入等操作的基因重組手段。

Cre重組酶（cyclization recombination enzyme）最早于1981年在P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，該酶由343個氨基酸組成，除了擁有催化活性外，同時還可以識別特定序列：Loxp位點，該位點同樣在P1噬菌體中被發(fā)現(xiàn)，序列長度為34bp[1]。當目的基因序列兩端插入相同方向的Loxp位點，同時有Cre重組酶存在時，Cre重組酶可將兩個Loxp位點之間的DNA序列剪除并重新將兩端環(huán)化連接，達到特異性基因敲除的目的，如圖1b所示[2]。而當目的基因序列兩端插入方向相反的Loxp序列時，Cre可導致Loxp之間的序列發(fā)生反轉，如圖1c所示[2]。
 

圖1. Cre-Lox基因重組系統(tǒng)工作原理[2]

利用Cre-Lox系統(tǒng)如何制備條件性敲除小鼠
Cre-Lox系統(tǒng)的優(yōu)勢在于可以利用組織特異性啟動子特異性控制Cre在特定組織的表達，以實現(xiàn)在特定組織細胞中對目的基因的敲除或改造，更好的規(guī)避全身敲除小鼠的胚胎致死現(xiàn)象。

1. Cre鼠的類型及應用
為了更好的控制Cre重組酶的表達時間，通過使用具有雌激素受體的突變配體結合結構域的Cre融合蛋白（Cre-ERT），可以實現(xiàn)對Cre活性的時間控制，該蛋白可以通過他莫昔芬誘導而被激活[1]。在無他莫昔芬誘導時，Cre-ERT融合蛋白與熱激蛋白Hsp90結合，定位于細胞質中；當他莫昔芬給藥誘導時，Hsp90脫離Cre-ERT融合蛋白，使Cre-ERT融合蛋白暴露核定位信號進入細胞核，發(fā)揮基因重組的作用[3]。這一融合蛋白的介入相當于為Cre-Lox系統(tǒng)加裝了一個由他莫昔芬控制的外源開關，使得體內基因編輯更具時空靈活性。為了提升該系統(tǒng)的靈敏性、特異性，ER配體結合結構域被進一步突變?yōu)镃re-ERT2，該系統(tǒng)對他莫昔芬代謝活性物質4-羥基他莫昔芬（TAM主要通過肝臟的細胞色素P450酶代謝為活性產物4-OH-TAM）的敏感性提升了10倍[4]。同樣的，Cre-ERT2并非完美無暇，Poorva Sandlesh等人研究發(fā)現(xiàn)CreERT2-Lox系統(tǒng)在敲除SSRP1的應用中，存在效率過低問題[5]。

Cre鼠常用于與Flox小鼠雜交進行條件性的目的基因敲除，但也有研究將Cre鼠用于切割位于報告基因前的終止序列，以達到熒光標記特定細胞的目的，進一步研究細胞命運。

2. Flox鼠與Cre鼠的配繁
在實際應用中，通過不同的Flox鼠與Cre鼠的配繁可以實現(xiàn)多種研究目的，通過組織/細胞特異性Cre鼠敲除特定組織/細胞群體的特定基因是最為常見的一種。

F0代與野生鼠互配獲得F1代雜合子，F(xiàn)1代雜合子（flox/+）互配得到F2代純合子（flox/flox），F(xiàn)2代純合子（flox/flox）與全身/組織特異性工具鼠交配獲得F3代（flox/+, Cre），F(xiàn)3代（flox/+, Cre）互配得到F4代（flox/flox, Cre），即cKO/cKI純合子。
 

圖2. 條件性敲除（敲入）鼠建系流程

CAUTION！
（1）如果是通過打靶構建的全身/組織特異性工具鼠，要注意選擇與目的基因不在同一條染色體上，以免繁殖不到cKO/cKI純合子。

（2）有生殖細胞泄露風險的Cre工具鼠，繁殖時按照建議性別選擇不同基因型鼠。

（3）誘導型的Cre工具鼠，需要加藥后才能實現(xiàn)特異組織刪除。

（4）F1代若有剩余的flox雜合鼠（flox/+），或想要加快獲得目標鼠，第2步可以用flox/+直接配Cre工具鼠，可縮短一代周期。

（5）即使是組織特異性工具鼠，也可能在其他組織有泄露表達的風險。

條件性敲除小鼠的應用
在科研中，條件性敲除小鼠的應用對探究基因或蛋白在體內作用及分子機制有著重要意義。下文以賽業(yè)生物客戶發(fā)表在《Nature Communications》雜志上的一篇題為Hematopoietic PBX-interacting protein mediates cartilage degeneration during the pathogenesis of osteoarthritis的文章為例，對條件性基因敲除小鼠的應用加以說明。

之前的研究認為HPIP蛋白主要在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起調節(jié)作用，該文為了研究HPIP在骨關節(jié)炎中的作用，分析了118對骨關節(jié)炎軟骨組織及相應非病變樣本中HPIP的表達水平。結果顯示，骨關節(jié)炎軟骨中HPIP的表達明顯高于非病變組織。而且，HPIP的表達隨著骨關節(jié)炎的發(fā)展而逐漸增加，而細胞外基質（ECM）組分COL2A1和ACAN的表達逐漸減少，表明它可能參與關節(jié)軟骨退化中的ECM降解。

研究者通過將Col2a1-CreERT2基因型小鼠與HPIP flox/flox小鼠雜交兩代后獲得Col2a1-CreERT2; HPIP flox/flox小鼠，即誘導后可以在在ECM中敲除HPIP基因的基因工程小鼠模型，染色結果表明，與對照組小鼠相比，敲除組小鼠表現(xiàn)出明顯的骨骼異常，敲除組小鼠肱骨、股骨、脛骨和椎骨等骨骼的長度比對照小鼠短10-21%。隨后研究人員分別將兩組小鼠膝關節(jié)中的前十字韌帶切除，并檢查手術后的軟骨厚度和覆蓋面積。結果顯示在手術后4周和8周時，對照組小鼠的軟骨厚度和覆蓋面積都低于條件性敲除組小鼠。一系列結果均指出，HPIP基因的條件性敲除可以防止骨關節(jié)炎的發(fā)展。該文章對于基因工程小鼠的應用有效的彌補了臨床樣本的病程中相關數(shù)據(jù)，與臨床樣本聯(lián)合揭示了HPIP在骨關節(jié)炎中的作用。

圖3. HPIP的敲除可以防止骨關節(jié)炎的發(fā)展[6]

參考文獻：

[1] Nagy, A., Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis, 2000. 26(2): p. 99-109.

[2] Friedel R.H., et al., Generating Conditional Knockout Mice. Transgenic Mouse Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology, 2011. 693.

[3] Zhang, J., et al., Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era. J Zhejiang Univ Sci B, 2012. 13(7): p. 511-24.

[4] Indra, A.K., et al., Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ER(T) and Cre-ER(T2) recombinases. Nucleic Acids Res, 1999. 27(22): p. 4324-7.

[5] Sandlesh, P., et al., Uncovering the fine print of the CreERT2-LoxP system while generating a conditional knockout mouse model of Ssrp1 gene. PLoS One, 2018. 13(6): p. e0199785.

[6] Ji Q., et al., Hematopoietic PBX-interacting protein mediates cartilage degeneration during the pathogenesis of osteoarthritis. Nat Commun. 2019 18;10(1): p. 313.

本文來自賽業(yè)生物(www.cyagen.com)