1、儲(chǔ)存液的配制：用 DMSO 配制 10 mM 的 H2DCFDA (2,000×)，如用 1.03 mL DMSO 溶解 5 mg H2DCFDA。

注：H2DCFDA 儲(chǔ)存液建議分裝后-20℃ 避光凍存，一個(gè)月。-80 半年。

2、工作液的配制：用預(yù)熱好的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液 (如 PBS) 稀釋儲(chǔ)存液，配制終濃度為 5-10 μM 的 H2DCFDA 工作液 (1×)。
注：H2DCFDA 工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配，具體濃度可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。

a) 以 6 孔板為例，接種適量數(shù)目的細(xì)胞，37℃，培養(yǎng)過夜。

b) 細(xì)胞密度達(dá)到 80%-90% 后，進(jìn)行染色處理或陽(yáng)性/陰性對(duì)照處理 (選做)。

d) 去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基直至無殘留，每孔添加 1 mL 1×H2DCFDA 工作液，37℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 30 分鐘。

e) 400 g，4℃ 離心 3-4 分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。

f) PBS 再次清洗細(xì)胞，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 H2DCFDA。

圖 1. 懸浮與貼壁細(xì)胞染色流程圖 (有對(duì)照)。

注：若用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)貼壁細(xì)胞，可先對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行消化、收集，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測(cè)方法。

哺乳細(xì)胞染色：以 Photodynamic therapy induces autophagy-mediated cell death in human colorectal cancer cells via activation of the ROS/JNK signaling pathway 一文中探針使用為例，研究者先使用 m-THPC 或 Verteporfin 處理 HCT116 細(xì)胞，然后使用 H2DCFDA 染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量 ROS 的產(chǎn)生。如圖所示，HCT116 細(xì)胞中 ROS 的產(chǎn)生以時(shí)間依賴性方式增加。

圖 2. HTC116 細(xì)胞用 0.35 μM Verteporfin  處理，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) ROS 水平^[1]

植物細(xì)胞染色：以 FERONIA receptor kinase-regulated reactive oxygen species mediate self-incompatibility in Brassica rapa 一文為例，在這篇文章中，為了證明 ROS 產(chǎn)生是否參與十字花科植物的自交不親和反應(yīng)，對(duì)未授粉 (UP)，自花授粉（SI），親和授粉（CP) 的柱頭，進(jìn)行了 ROS 染色。

結(jié)果表明，與未授粉 (UP) 柱頭的穩(wěn)態(tài) ROS 水平相比，自花授粉后 1 min ROS開始顯著增加，30 min 內(nèi)達(dá)到最大值 (圖 2A)。用 H2DCFDA 和 細(xì)胞壁指示劑 PI 共染色柱頭，ROS 位于乳頭細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，靠近質(zhì)膜外圍(圖 1C)。上述結(jié)果表明，自花花粉在大白菜的柱頭乳頭細(xì)胞中觸發(fā)了高水平的活性氧 (ROS)，可能參與自交不親和 (SI) 的發(fā)生。

 HKPerox-2：H₂O₂ 作為一種穩(wěn)定的活性氧成分，在氧化損傷和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中也是發(fā)揮著很重要作用的。下面圖 5a 就可以看出對(duì) H₂O₂ 的高選擇性。此外，用 H₂O₂ 處理細(xì)胞，HKPerox-2 的熒光 30 分鐘內(nèi)就可以到達(dá)巔峰。染色效果看圖5c，亮眼的綠色熒光。使用方法和 H2DCFDA 的差不多。

圖5. HKPerox-2 用于 H₂O₂ 檢測(cè)

a. HKPerox-2 對(duì) H₂O₂ 的選擇性 b. HKPerox-2 熒光強(qiáng)度 c. HKPerox-2 細(xì)胞染色效果

 HKSOX-1、 HKOH-1r：分別是超氧陰離子自由基 (O₂^•−)和羥基自由基 (•OH) 熒光探針。動(dòng)物細(xì)胞操作同上，使用濃度、孵育時(shí)間如有雷同純屬巧合。

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參考文獻(xiàn)

1. Changfeng Song, Wen Xu, Hongkun Wu, Xiaotong Wang et al. Photodynamic therapy induces autophagy-mediated cell death in human colorectal cancer cells via activation of the ROS/JNK signaling pathway. Cell Death Dis. 2020 Oct 31;11(10):938.