免疫檢查點(diǎn)阻斷治療法目前已應(yīng)用于多種乳腺癌亞型的治療，但是患者的免疫應(yīng)答具有異質(zhì)性。這種決定治療效果異質(zhì)性的機(jī)制和標(biāo)志物的鑒定是該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。本研究中，研究者通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+TCR測(cè)序技術(shù)對(duì)接受抗PD1治療的乳腺癌患者治療前、中樣品進(jìn)行分析，探究治療前后腫瘤內(nèi)細(xì)胞表達(dá)特征的變化。

文章詳情

文章題目：A single-cell map of intratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer.

中文題目：乳腺癌患者抗PD1治療期間腫瘤內(nèi)變化的單細(xì)胞圖譜

發(fā)表時(shí)間：2021.5

期刊名稱：Nature Medicine

影響因子：36.131

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：10x Genomics Chromium（5‘表達(dá)文庫(kù)+TCR VDJ富集文庫(kù)）、CITE-seq

樣本類型和數(shù)量：

激素受體陽(yáng)性或三陰性乳腺癌患者的治療前和治療中配對(duì)的活檢樣品，接受抗PD1治療患者（n=29）和新輔助化療后接受抗PD1治療患者（n=11）

DOI：10.1038/s41591-021-01323-8


研究背景

三陰性乳腺癌（TNBC）在乳腺癌（BC）患者占約15%，且其中具有大量腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs），說(shuō)明免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）可能是針對(duì)TNBC的較好的治療方式。而新輔助化療期間加入抗PD１治療早期TNBC可增加病理完全緩解率和無(wú)事件生存率。此外，新輔助ICB療法還可用于BC其他亞型（ER^＋和HER２^-）。然而，并不是所有BC患者都能對(duì)新輔助ICB療法應(yīng)答，因此探究其中的原因和鑒定能決定治療效果的相關(guān)標(biāo)志物就成為亟待解決的問(wèn)題。很多研究表明，T細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增是ICB治療反應(yīng)的基礎(chǔ)，使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可獲得T細(xì)胞擴(kuò)增的模式和機(jī)制。然而，目前的研究都只著眼于容易獲得的樣品、較少的患者數(shù)或只專注于CD45⁺免疫細(xì)胞。因此，研究者使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，單細(xì)胞TCR測(cè)序和CITE-seq方法對(duì)40例患者組織進(jìn)行測(cè)序，以達(dá)到鑒定BC患者ICB治療應(yīng)答機(jī)制的目的。


研究?jī)?nèi)容

// 抗PD1治療前和治療中的單細(xì)胞圖譜分析

研究者所用的兩個(gè)研究隊(duì)列：１.未經(jīng)治療的非轉(zhuǎn)移性原發(fā)性乳腺浸潤(rùn)癌患者在手術(shù)前大約９±２天接受pembrolizumab（Keytruda或抗PD1）治療；2.接受了為期20-24周的新輔助化療，隨后在手術(shù)前接受了pembrolizumab治療。在兩個(gè)隊(duì)列中，“治療前”樣品指在抗PD1治療前立即收集的活檢組織，“治療中”樣品指在手術(shù)中收集的，包含了不同的BC亞型患者。

針對(duì)隊(duì)列1的配對(duì)樣品使用單細(xì)胞免疫組庫(kù)測(cè)序（轉(zhuǎn)錄組+TCR），獲得了惡性乳腺上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。其中，惡性乳腺上皮細(xì)胞拷貝數(shù)不穩(wěn)定，且在患者中的分布具有特異性，治療前、中的組織或不同BC亞型之間沒(méi)有聚類偏倚。TCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)9名患者的配對(duì)樣品均發(fā)生克隆性擴(kuò)增，研究者命名其為“E（s）”，其他20名命名為“NE（s）”。治療過(guò)程中一些克隆型消失了，說(shuō)明T細(xì)胞發(fā)生了克隆型收縮，不過(guò)克隆型收縮沒(méi)有克隆型擴(kuò)增明顯，且在Es和NEs中平均分布。值得注意的是，有些NE（n=11）治療前T細(xì)胞比例較高，但在抗PD1治療后不能擴(kuò)增。其余的NEs 的T細(xì)胞頻率較低而且也不能擴(kuò)增。此外，治療中樣品里61%的擴(kuò)增T細(xì)胞的克隆型在治療前就已存在。
 

Fig 1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、細(xì)胞注釋和T細(xì)胞表現(xiàn)型

 

// 表達(dá)PD1的T細(xì)胞在抗PD1治療后增殖

接下來(lái)，研究者根據(jù)不同分組比較單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)果。治療前，成纖維細(xì)胞多見(jiàn)于NEs中，T細(xì)胞則多見(jiàn)于Es中。治療中，癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在NEs中更多見(jiàn)，T細(xì)胞在Es中進(jìn)一步富集。對(duì)T細(xì)胞做亞亞群分析鑒定到表達(dá)PD1的CD8⁺和 CD4⁺細(xì)胞群（具有耗竭樣特征的活化T細(xì)胞），并命名為T(mén)EX cells。研究者還鑒定到一個(gè)高度增殖的T細(xì)胞組成的PD1⁺細(xì)胞群，在治療前、中相對(duì)豐度高，且在治療過(guò)程中增加。在治療中，擴(kuò)增T細(xì)胞主要由CD4⁺和CD8⁺TEX 細(xì)胞組成，但也有一部分CD8⁺效應(yīng)/記憶細(xì)胞。Es與NEs相比，治療前、中樣品的T細(xì)胞克隆性和Gini指數(shù)增加，TEX cells克隆性最強(qiáng)，而克隆型豐度則恰好相反。此外，通過(guò)CITE-seq證實(shí)Es治療前T細(xì)胞的PD1蛋白表達(dá)增加�？傊�，PD1⁺T cells的比例與T細(xì)胞擴(kuò)增相關(guān)，CD8⁺和CD4⁺TEX 細(xì)胞是抗PD1治療后主要的擴(kuò)增T細(xì)胞。

// 沿CD８^＋TEX或CD4^＋TH1、TFH細(xì)胞軌跡的T細(xì)胞擴(kuò)增治療后增殖

研究者構(gòu)建了CD8⁺T細(xì)胞的偽時(shí)間軌跡。T_N細(xì)胞是軌跡的起點(diǎn)，連接T_EM細(xì)胞，隨后出現(xiàn)三條分支：T_EX1和T_EX2、T_RM、T_EMRA。Es與NEs相比，無(wú)論是治療前和治療中，TEX細(xì)胞更多見(jiàn)于軌跡的末端。Es治療中的T_EX細(xì)胞具有更多的“顯著效應(yīng)活性”和“短暫/早期耗竭”特征。此外，在所有軌跡中，Es比NEs具有更少的TCR豐度，與治療前相比，治療中的TCR豐度減少更明顯，說(shuō)明抗PD1誘導(dǎo)T細(xì)胞擴(kuò)增。擴(kuò)增的TEX細(xì)胞在軌跡末尾處富集，尤其是治療過(guò)程中。

在CD4⁺T細(xì)胞軌跡中，T_EX細(xì)胞分裂成T_H1和T_FH細(xì)胞。軌跡從T_N1出發(fā)，向T_N2移動(dòng)，隨后是T_EM1-3，然后分裂成T_H1或T_FH細(xì)胞。NEs中的這2類細(xì)胞治療前和治療中都保持早期的前效/記憶狀態(tài)，而Es治療中，T細(xì)胞活性和早期耗竭標(biāo)志物表達(dá)增加。TCR豐度在接近軌跡末端時(shí)下降，尤其是在Es的T_H1細(xì)胞里。而在Es治療中，增殖在接近末端時(shí)增加。當(dāng)沿著軌跡比較擴(kuò)增和非擴(kuò)增的CD4⁺T細(xì)胞時(shí)，T_H1和T_FH細(xì)胞在軌跡末期富集，尤其是Es治療中。總體而言，T_H1和T_FH細(xì)胞對(duì)克隆型擴(kuò)增有重要貢獻(xiàn)，表明它們支持CD8⁺ TEX細(xì)胞正在進(jìn)行的效應(yīng)功能。另外，沿著CD8⁺TEX細(xì)胞或CD4⁺T_H1細(xì)胞軌跡分析基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)了Es和NEs中表達(dá)或激活的差異基因和信號(hào)通路。

Fig 2. CD8⁺和CD4⁺T細(xì)胞軌跡分析

//  T細(xì)胞表達(dá)特征預(yù)測(cè)T細(xì)胞擴(kuò)增

將治療前擴(kuò)增和非擴(kuò)增T細(xì)胞比較篩選差異基因并結(jié)合GSEA分析發(fā)現(xiàn)，非擴(kuò)增T細(xì)胞更加naive，而擴(kuò)增T細(xì)胞則具有效應(yīng)功能、免疫細(xì)胞歸巢、細(xì)胞毒性、抗原提呈特性，同時(shí)也主要表達(dá)免疫檢查和腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞marker基因�？寺⌒蛿U(kuò)增的數(shù)量也與這些基因及其相關(guān)通路有關(guān)。治療前Es與NEs相比，免疫檢查標(biāo)志物和CD4⁺T_H1活性預(yù)測(cè)T細(xì)胞擴(kuò)增效果最好。CITE-seq結(jié)果證實(shí)NEs中的naive T細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)更高，而免疫檢查點(diǎn)、腫瘤反應(yīng)性和共刺激標(biāo)志物表達(dá)更低。將TNBC Es（n=5）與ER+BC（n=3）比較發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的克隆型數(shù)量沒(méi)有差異，但TNBC中，治療前T細(xì)胞的PD1表達(dá)和增殖T細(xì)胞數(shù)量更高。與ER+Es比較，TNBC中擴(kuò)增性CD8⁺T細(xì)胞效應(yīng)功能上調(diào)，而其中的CD4⁺T細(xì)胞上調(diào)表達(dá)抗原提呈基因。相反地，ER+Es的擴(kuò)增性CD8⁺、CD4⁺T細(xì)胞過(guò)表達(dá)naive和前效相關(guān)標(biāo)志物，說(shuō)明與TNBC相比雖然T細(xì)胞擴(kuò)增程度相似，但分化程度較低。
 

Fig 3. BC和BC亞型中的擴(kuò)增性與非擴(kuò)增性T細(xì)胞比較

// 新輔助化療和抗PD1治療后的T細(xì)胞擴(kuò)增

研究者使用相同研究策略分析隊(duì)列２的治療前和治療中樣品，得到了3名Es。在Es中，T細(xì)胞和pDCs增多，在治療前、中樣品，PD1表達(dá)和CD4⁺及CD8⁺TEX細(xì)胞均增多。比較治療前擴(kuò)增和非擴(kuò)增T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了與只接受抗PD1的患者相似的差異基因或信號(hào)通路。T_H1活性和其中的50個(gè)特征差異基因可有效預(yù)測(cè)T細(xì)胞擴(kuò)增，證明當(dāng)新輔助化療與抗PD1結(jié)合時(shí)，CD4⁺T_H1細(xì)胞也參與T細(xì)胞擴(kuò)增。

// 樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞擴(kuò)增的關(guān)系

將隊(duì)列1患者得到的DC再分群獲得了6個(gè)DC亞群。與NEs相比，Es的PD-L1和PD-L2表達(dá)量增加，在DC中，PD-L1只在mregDC亞群表達(dá)。Es治療前的mregDC相對(duì)頻率較高，而其他類型DC的相對(duì)頻率在Es與NEs的治療前樣品中并無(wú)太大差異。pDC、ASDC和mregDC在Es治療中數(shù)量更多。此外，研究者還篩選了Es與NEs治療前、中的差異基因涉及的功能及通路�？傊�，DC在ES中，無(wú)論治療前還是治療中，都具有免疫應(yīng)答功能且支持T細(xì)胞功能。

與DC類似，巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1和PD-L2，在治療前，這兩個(gè)基因、幾個(gè)細(xì)胞因子（CXCL9等）和I/II型干擾素應(yīng)答基因在ES中的上調(diào)表達(dá)，而CX3CR1和C3下調(diào)表達(dá)。
 

Fig 4. 表達(dá)PD-L1的樹(shù)突細(xì)胞與巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞擴(kuò)增的關(guān)系

// T細(xì)胞擴(kuò)增的腫瘤中，癌細(xì)胞受抗PD1治療影響

在Es中，癌細(xì)胞數(shù)量隨治療變少。盡管在癌細(xì)胞中未能檢測(cè)到PD-L1的表達(dá)，但大量抗原提呈MHC I/II型基因在NEs中下調(diào)表達(dá)，與NEs相比，抗原加工及提呈和IFN-γ 應(yīng)答信號(hào)通路在Es中上調(diào)表達(dá)。將Es治療前、中相比較發(fā)現(xiàn)，治療中的癌細(xì)胞具有一種持續(xù)的抗腫瘤反應(yīng)，且富集細(xì)胞增殖、蛋白水解、細(xì)胞死亡、免疫信號(hào)和細(xì)胞毒性通路。最后，研究者分析了各類細(xì)胞的相對(duì)頻率與T細(xì)胞擴(kuò)增的相關(guān)性，并使用CellphoneDB分析配體受體互作關(guān)系，確認(rèn)了不同樣品細(xì)胞內(nèi)的共刺激與共抑制作用。

主要結(jié)論

本研究對(duì)象為在手術(shù)前進(jìn)行抗PD1治療的激素受體陽(yáng)性或三重陰性（TNBC）的乳腺癌（BC）患者，針對(duì)只接受抗PD１治療的患者（29例）或先接受新輔助化療后再接受抗PD1治療的患者（11例）的活檢組織（治療前和治療中的配對(duì)組織），進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、TCR和蛋白組分析。主要結(jié)論如下：

1. 三分之一腫瘤包含表達(dá)PD1的T細(xì)胞，這些T細(xì)胞在抗PD1治療后發(fā)生克隆性擴(kuò)增，而與腫瘤亞型無(wú)關(guān)。擴(kuò)增主要涉及CD8⁺T細(xì)胞（顯著表達(dá)細(xì)胞毒性、免疫細(xì)胞歸巢和耗竭標(biāo)志物）和CD4⁺T細(xì)胞（表達(dá)T-helper-1和follicular-helper標(biāo)志物）。

2. 在治療前活檢組織中，免疫調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞（PD-L1⁺）、特異性巨噬細(xì)胞表型（CCR2⁺、MMP9⁺）和主要組織相容性復(fù)合體I/II類表達(dá)的癌細(xì)胞的相對(duì)頻率與T細(xì)胞擴(kuò)增呈正相關(guān)。

3. 未分化的前效/記憶T細(xì)胞（Tcf7⁺、GZMK⁺）或抑制性巨噬細(xì)胞（CX3CR1⁺、C3⁺）與T細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān)。

這些數(shù)據(jù)分析結(jié)果確定了各種免疫表型和相關(guān)基因集，它們與抗PD１治療后T細(xì)胞擴(kuò)增呈正、負(fù)相關(guān)，并闡明乳腺癌患者抗PD1治療響應(yīng)的異質(zhì)性特征。

參考文獻(xiàn)
Bassez, Ayse et al. “A single-cell map ofintratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer.”Nature medicine vol. 27,5 (2021): 820-832.