近期，美國康奈爾大學(xué) Samie R. Jaffrey 研究組在 Cell 上發(fā)表了題為 “A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating m⁶A-Modified mRNA” 的研究，揭示了 YTHDF 蛋白調(diào)節(jié) m⁶A 修飾的 mRNA 的功能統(tǒng)一模型。

與“不同的 m⁶A 位點結(jié)合不同的 DF 蛋白”的主流觀點不同，該研究人員發(fā)現(xiàn)，所有 m⁶A 位點與三個 DF 蛋白都以基本相似的方式結(jié)合，它們以冗余的作用方式誘導(dǎo)同一子集的 mRNA 降解，沒有證據(jù)表明它們能直接促進翻譯。

圖 1. YTHDF 蛋白調(diào)控 m⁶A 修飾的 mRNA 的功能模型
m⁶A (N6-methyladenosine)：是指腺嘌呤核苷 N6 位置發(fā)生了甲基化修飾。m⁶A 是真核 mRNA 最普遍的內(nèi)部修飾，在功能上調(diào)節(jié)真核轉(zhuǎn)錄組，影響 mRNA 的剪接、輸出、定位、翻譯和穩(wěn)定性。
m⁶A 修飾有三類調(diào)節(jié)器：
Writer 甲基轉(zhuǎn)移酶 (MTC)，負責(zé)催化，例如 METTL3、METTL14 和 WTAP；
Eraser 去甲基化酶 (Demethylase)，負責(zé)去除甲基化，例如 FTO 和 ALKBH5；

Reader 直接識別和結(jié)合 m⁶A 位點，使 m⁶A 修飾的 RNA 發(fā)揮特定的作用，主要包括 YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3 等。

YTHDF：一種 m⁶A “閱讀器”，即 Reader。胞質(zhì)中的 YTHDF 家族包括了 YTHDF1、YTHDF2 和 YTHDF3 三種旁系同源物 (paralogs)，也可以簡稱為 DF1、DF2、DF3。據(jù)報道，三種 DF 有不同的功能，DF1 促進 mRNA 的翻譯，DF2 促進 mRNA 的降解，DF3 促進翻譯和降解。

關(guān)于 DF 旁系同源物選擇性地結(jié)合不同的 m⁶A 位點的機制目前尚未清楚。此外，DF 蛋白功能差異的機制基礎(chǔ)也仍不清楚，尤其是在它們同源性很高的情況下。

圖 2. 研究亮點

 

首先，研究人員觀察 DF1 和 DF2 YTH 結(jié)構(gòu)域與含有 m⁶A 的 RNA 的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)在整個轉(zhuǎn)錄組中，DF 蛋白結(jié)合 m⁶A 的氨基酸以及結(jié)合近端的氨基酸都是保守的，因此三個 DF 蛋白與 m⁶A 結(jié)合的結(jié)構(gòu)機制是相同的。

 

DF 旁系同源物結(jié)合 m⁶A 序列基序 (Sequence motifs) 的差異反映可以其結(jié)合特性，研究發(fā)現(xiàn) m⁶A 殘基幾乎只存在 DR-m⁶A-CH (D = A, G, U; R = A, G; H = A, C, U) 這一個高度保守的序列基序中，像 GG-m⁶A-CU、AG-m⁶A-CU 都屬于 DR-m⁶A-CH 的亞基序 (Submotif) 。

 

為了確定每種 DF 的結(jié)合偏好，研究人員通過全轉(zhuǎn)錄組 iCLIP 圖譜，檢測了 HEK293T 細胞內(nèi)源性表達的 DF1、DF2 和 DF3 的結(jié)合位點，分析發(fā)現(xiàn)三種 DF 結(jié)合位點序列亞基序的偏好相同。再結(jié)合已報道的 PAR-CLIP 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)即使用不同的細胞系和不同的 CLIP 方法，DF 旁系同源物的 RNA 結(jié)合基本相同。因此， DF 旁系同源物的 m⁶A 結(jié)合模式相同。

圖 3. DF 蛋白與 m⁶A 結(jié)合位點的轉(zhuǎn)錄組分析

 

但是，不同的 DF 如何對 m⁶A-mRNAs 發(fā)揮不同的分子效應(yīng)這個問題仍未解決，研究人員又分析了 DF 旁系同源物之間的效應(yīng)區(qū)域差異，以及它們的相互作用蛋白 (不同的 DF 蛋白可能通過與不同的蛋白相互作用介導(dǎo)其不同的功能)。結(jié)果顯示，DF 旁系同源物的序列、功能域、相互作用蛋白和細胞內(nèi)定位都高度相似。

 

此外，研究人員還發(fā)現(xiàn) DF 蛋白與降解有關(guān)的因子相互作用可信度較高，與翻譯相關(guān)的因子相互作用可信度較低。

 

根據(jù)已有報道，研究人員考慮到每種 DF 蛋白都有介導(dǎo) m⁶A-mRNA 降解的可能性。于是，他們利用 siRNA 選擇性敲降 HeLa 細胞中的 DF1、DF2 和 DF3，使用 RNA-seq 檢測 mRNA 的豐度，證實是 DF2 影響了 m⁶A-mRNA 穩(wěn)定性，而非 DF1 或 DF3。

圖 4. DF 蛋白冗余地控制 m⁶A-mRNA 的豐度和穩(wěn)定性

再對 DF 進行不同組合的雙重敲降和三重敲降，并利用放線菌素 D (Actinomycin D) 抑制轉(zhuǎn)錄后 m⁶A-mRNA 的水平證明了：DF 蛋白的聯(lián)合活性導(dǎo)致 m⁶A 修飾的 mRNA 降解，DF 旁系同源物在功能上可以互相補償，這種補償功能也受其表達水平限制。當(dāng)三種 DF 都耗竭時，補償就不會發(fā)生，這時 m⁶A-mRNA 的穩(wěn)定性得到最大程度的提高。
接下來，研究人員檢測了 DF 在 m⁶A-mRNA 的翻譯調(diào)控中的作用。三種 DF 都與多聚核糖體組分無關(guān)，而富集于信使核糖核蛋白 (mRNP) 組分，該結(jié)果與 “DF 蛋白(任何一種) 穩(wěn)定地結(jié)合至 mRNA 3'UTR，增強其翻譯的模型” 不一致。

任何的 DF 旁系同源物基因沉默都不影響 HeLa 細胞中 mRNA 的翻譯效率，即使是 DF 三重敲降也沒有顯著降低翻譯效率。因此，任何一種 DF 同源旁系物都不能直接增強 mRNA 的翻譯，相反的，它們的主要作用是介導(dǎo) m⁶A-mRNA 降解。

圖 5. DF 蛋白冗余地抑制白血病細胞的分化

 

已有報道 DF2 在急性髓系白血病 (AML) 中過表達，與 AML 的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，DF2 的缺失導(dǎo)致一些抑制 AML 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，例如在 DF2 敲除的白血病前期細胞中，TNFRSF1B 轉(zhuǎn)錄本的半衰期增加，表面 TNFR2 的表達量上升。
為探索 TNFRSF1B 的抑制是否是通過三種 DF 蛋白共同作用介導(dǎo)，研究人員對 MOLM-13 白血病細胞中的 DF 進行單獨或聯(lián)合敲降，發(fā)現(xiàn) TNFRSF1B mRNA 表達水平受 DF 的單獨敲降影響較小，其中僅 DF2 的敲降使其略微升高，在三重敲降后卻顯著上調(diào)。因此，在 MOLM-13 細胞中 DF 蛋白共同作用控制 m⁶A-mRNA 的表達水平。

 

相關(guān)抑制劑	作用
SAH	氨基酸衍生物和幾種代謝途徑中的調(diào)節(jié)劑。METTL3-METTL14 異二聚體復(fù)合物 (METTL3-14) 的抑制劑
3-Deazaadenosine	S-腺苷高半胱氨酸 (SAH) 水解酶抑制劑；通過抑制 SAH 水解來抑制 m6A 基團插入 mRNA 底物中
IOX1	甲基轉(zhuǎn)移酶 ALKBH5 抑制劑
FB23-2	有效、選擇性的 mRNA m6A 去甲基酶 FTO 抑制劑
FG-2216/IOX3	HIF-PHD 抑制劑；在體外對 FTO 有抑制作用
Rhein	可逆地與 FTO 催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并競爭性地阻止了對 m6A 修飾底物的識別
Entacapone	特異的外周活性的鄰苯二酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶 (COMT) 抑制劑；競爭性 FTO 抑制劑
Meclofenamic acid	非甾體類抗炎化合物；FTO 抑制劑

 

縮寫：

MTC: Methyltransferase complex
YTHDF: YT521-B homology domain-containing family/YTH domain family

 

原文閱讀：Sara Zaccara, et al. A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating M 6A-Modified mRNA. Cell. 2020 Jun 25;181(7):1582-1595.e18.

參考文獻

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1. Sara Zaccara, et al. A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating M 6A-Modified mRNA. Cell. 2020 Jun 25;181(7):1582-1595.e18.
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3. Si‐Yu Liu, et al. m6A facilitates YTHDF‐independent phase separation. J Cell Mol Med. 2020 Jan; 24(2): 2070–2072.
4. Hailing Shi, et al. Where, when and how: context-dependent functions of RNA methylation writers, readers, and erasers. Mol Cell. Author manuscript; available in PMC 2020 May 16.
5. Jasmin Paris, et al. Targeting the RNA m6A Reader YTHDF2 Selectively Compromises Cancer Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Cell Stem Cell. 2019 Jul 3; 25(1): 137–148.e6.