近日，Cell 在線發(fā)表的論文 “Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer’s Disease” 中，研究團(tuán)隊在 AD 小鼠模型中，利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究淀粉樣斑塊周圍直徑 100 μm 的組織結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄變化，證明了豐富的髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞基因 (OLIGs) 的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的早期改變，而斑塊誘導(dǎo)基因 (PIGs) 的多細(xì)胞基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)涉及補(bǔ)體系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、溶酶體和炎癥，在疾病的后期表現(xiàn)突出。研究人員通過對小鼠和人腦切片的原位測序，證實了細(xì)胞水平上觀察到的大部分變化。全基因組空間轉(zhuǎn)錄組分析提供了一個新的方法，以揭示 AD (淀粉樣蛋白沉積) 和其他腦疾病的致病標(biāo)志物周圍的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)失調(diào)。

 
研究背景
 

淀粉樣斑塊與神經(jīng)變性過程的關(guān)系是 AD 研究中的一個核心問題。自從“淀粉樣蛋白沉積”的病理現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)后，一個世紀(jì)以來，科學(xué)界展開了大量的研究，直到現(xiàn)在這種現(xiàn)象與 AD 疾病發(fā)展之間的關(guān)系仍未明了。已知：

 

1、淀粉樣斑塊可能起 AD 的觸發(fā)或驅(qū)動作用。

 

2、散發(fā)性 AD 的風(fēng)險與小膠質(zhì)細(xì)胞中響應(yīng)淀粉樣蛋白沉積的基因表達(dá)相關(guān)，星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞也表現(xiàn)出對淀粉樣斑塊的分子反應(yīng)。

 

3、在 AD 中，將神經(jīng)元、各種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分離再檢測胞質(zhì) mRNA 結(jié)果并不理想，還可能人為的影響表達(dá)圖譜，導(dǎo)致大多數(shù)空間信息的丟失，包括細(xì)胞和淀粉樣斑塊的關(guān)系�？臻g條形碼陣列 (Spatially barcoded arrays) 支持進(jìn)行組織中無偏倚的轉(zhuǎn)錄組分析，維持已測序分子的空間定位。

 

Bart De Strooper 和 Mark Fiers 研究團(tuán)隊通過一種開創(chuàng)性技術(shù)來具體研究斑塊附近的腦細(xì)胞中發(fā)生的變化。

 

圖 1. 研究概要圖

 
文章概要
 

在小鼠和人腦樣本中，該研究結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組法和原位測序的實驗方法，顯示了 AD 中的多細(xì)胞基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。研究團(tuán)隊鑒定了兩個由淀粉樣斑塊沉積誘導(dǎo)表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，一個是斑塊誘導(dǎo)基因 (PIG) 網(wǎng)絡(luò)，主要涉及小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞；另一個是少突膠質(zhì)細(xì)胞基因 (OLIG) 和髓鞘反應(yīng)。

 
主要研究方法
 

空間轉(zhuǎn)錄組方法 (ST)

正交原位測序方法 (ISS)

RNAscope 原位雜交技術(shù)

免疫熒光檢測技術(shù)

 
小鼠模型
 

 

App^NL-G-F小鼠 (AD 小鼠模型，App gene：淀粉樣前蛋白基因)

C57BL/6 小鼠

 

研究結(jié)果
 

研究團(tuán)隊對 AD 小鼠的 10,327 個組織域 (TD) 空間轉(zhuǎn)錄組 (ST) 圖譜根據(jù)大腦區(qū)域進(jìn)行聚類，并通過 WGCNA (基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，基于具有相似表達(dá)模式的基因可能具有相似的功能) 劃分模塊。作者重點介紹了對 β-淀粉樣蛋白 (Aβ) 高度敏感的兩個 WGCNA 模塊：PIGs 和 OLIGs。

 

圖 2. Gene Ontology 分析和 WGCNA 分析

(purple: PIGs; red: OLIGs)

 

■ PIG 模塊

 

斑塊誘導(dǎo)基因 (Plaque-induced gene, PIG) 主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，體現(xiàn)了它們之間的細(xì)胞間串?dāng)_，并涉及其他細(xì)胞。這種相互作用使經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)和內(nèi)體/溶酶體途徑伴隨著改變。

 
為了了解基因表達(dá)的變化，研究人員進(jìn)行了兩次差異表達(dá)分析。第一次比較 App^NL-G-F 小鼠與 C57BL/6 小鼠 (基因型模型，基因型軸)，第二個研究 Aβ 沉積對基因表達(dá)的影響 (Aβ 模型，Aβ 軸) 。
 
在 App 敲入的 AD 小鼠模型中，淀粉樣蛋白斑塊微環(huán)境中逐步建立一種多細(xì)胞共同表達(dá)的基因反應(yīng)。其中包括 57 個 PIGs，在 Aβ 軸和基因型軸在晚期 (18 個月大小鼠) 反應(yīng)最為活躍，這些基因在早期 (3 個月) 只是輕微上調(diào)，經(jīng)歷一個急劇上升到晚期穩(wěn)定的過程。因此，PIG 的表達(dá)隨著在整個腦區(qū)域中 Aβ 的積累而逐漸增加。
 
該模塊中涉及了經(jīng)典補(bǔ)體級聯(lián) (如 C1qa，C1qb，C1qc 等)，還有補(bǔ)體級聯(lián)所觸發(fā)的效應(yīng)機(jī)制，如內(nèi)吞作用 (如 Fcer1g，Fcgr3，B2m 等)，溶酶體降解 (如 Hexa，Hexb，Ctsa  等) ，抗原加工提呈、免疫應(yīng)答和氧化還原過程。此外，PIG 模塊的細(xì)胞標(biāo)志與激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞有很高的重疊性。
 

圖 3. PIG 與 ARM/DAM 
小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞部分重疊 
(DAM：疾病相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞；
ARM：激活反應(yīng)的小膠質(zhì)細(xì)胞)
 

其他實驗補(bǔ)充：ST 結(jié)果顯示了淀粉樣斑塊周圍有多細(xì)胞反應(yīng)，但 ST 技術(shù)無法達(dá)到單細(xì)胞水平，因此研究團(tuán)隊還通過 ISS 在單細(xì)胞水平上作為對實驗進(jìn)行補(bǔ)充，ISS 的結(jié)果與 ST 的結(jié)果具有很好的相關(guān)性。PIG 網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞標(biāo)志顯示，PIG 對 Aβ 的反應(yīng)在很大程度上是由小膠質(zhì)細(xì)胞引起的，在較小程度上由星形膠質(zhì)細(xì)胞引起的。利用 RNAscope 原位雜交驗證了補(bǔ)體組分 (C1qa，C4 和 Clu) 在晚期 AD 小鼠模型中的表達(dá)，這 3 個補(bǔ)體組分的細(xì)胞標(biāo)志與 ISS 分析一致。

 

圖 4. 隨著 Aβ 沉積逐步建立的 PIGs 的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

 

PIGs 中小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞基因的共表達(dá)：根據(jù) Aβ 沉積水平將所有 ST TD 分為 WT 和 AD 的四個等級，WGCNA 生成一個指示基因之間相關(guān)性的共表達(dá)通用矩陣，隨著 Aβ 積累的增加，基因聯(lián)系的“劑量”敏感性 (Dose-sensitive) 增加，顯示了表達(dá)網(wǎng)絡(luò)隨著 Aβ 暴露的增加而逐步建立。

 

■ OLIG 模塊

 

少突細(xì)胞基因 (oligodendrocyte gene, OLIG) 為髓鞘化相關(guān)基因，主要由少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。

 

WGCNA 第二個大的模塊由主要由少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的 165 個基因組成，被稱為 “OLIG 模塊”。實驗證明，OLIG 模塊在中度 Aβ 暴露時高表達(dá)，但是在重度 Aβ 暴露的微環(huán)境中下降。因此，OLIG 模塊表達(dá)的大腦區(qū)域差異與 Aβ 表達(dá)程度相關(guān)。

 

圖 5. OLIG 模塊對 Aβ 積累的響應(yīng)
(Oli0：人類 AD 相關(guān)的少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的小鼠直系同源物)

 

總的來說，該研究證實了 OLIGs 的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)在疾病早期改變，而 PIGs 的多細(xì)胞基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)涉及補(bǔ)體系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、溶酶體和炎癥，在疾病的后期表現(xiàn)突出。

 

■ 人腦中 PIG 和 OLIG 模塊的可視化

 

研究人員對 AD 患者額上回組織樣本的 222 個基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，包括 PIGs 的 45 個人類同源序列表達(dá)，OLIG 模塊中 42 個斑塊反應(yīng)性基因同源序列的表達(dá)，以及一系列的細(xì)胞類型標(biāo)志，如預(yù)期一樣，PIG 模塊和 OLIG 模塊基因分別在灰質(zhì)和白質(zhì)中富集。使用同樣的 ISS 方法研究了 PIGs 在對照和 AD 腦中人類直系同源物的分布，證明了 AD 患者中與疾病相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)活化。
 

圖 6. 人腦中 PIG 和 OLIG 模塊的分析

 
結(jié)論：
 
實驗技術(shù)：展示了最近開發(fā)的 ST 和 ISS 技術(shù)在腦疾病方面的應(yīng)用。
實驗結(jié)果：數(shù)據(jù)表明，淀粉樣斑塊在疾病發(fā)展中“并非無辜”，實際上，它誘導(dǎo)了周圍所有細(xì)胞的強(qiáng)烈和協(xié)調(diào)的反應(yīng)。因此，還需要進(jìn)一步的工作來了解是否以及何時去除淀粉樣蛋白斑塊足以逆轉(zhuǎn)正在進(jìn)行的細(xì)胞過程。另外，抗體結(jié)合淀粉樣斑塊將調(diào)節(jié)這些膠質(zhì)反應(yīng)有待確定，這會使臨床試驗的結(jié)果的解釋復(fù)雜化，因為細(xì)胞效應(yīng)可能因抗體而異。

 

 

相關(guān)化合物庫	作用
神經(jīng)保護(hù)化合物庫	收錄了 400+ 種具有潛在神經(jīng)保護(hù)作用的化合物，這些化合物主要靶向神經(jīng)保護(hù)通路中的主要靶點，如鈣離子通道，鈉離子通道，腺苷 A1 受體等；是開發(fā)神經(jīng)保護(hù)藥物，研究神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的有效工具。
抗阿爾茨海默病化合物庫	收錄了 400+ 種具有抗阿爾茲海默病活性的化合物及靶向阿爾茲海默病主要靶點的化合物；是研究阿爾茲海默病發(fā)病機(jī)制及開發(fā)抗阿爾茲海默病藥物的有用工具。
神經(jīng)信號化合物庫	收錄了 1300+ 種神經(jīng)信號相關(guān)的小分子化合物，是研究神經(jīng)調(diào)控及神經(jīng)疾病的有用工具。
神經(jīng)遞質(zhì)受體化合物庫	提供 900+ 種神經(jīng)遞質(zhì)受體相關(guān)的化合物，可以用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物的篩選。
可透過中樞神經(jīng)系統(tǒng)化合物庫	收錄了 400+ 個具有明確報道可以透過血腦屏障的小分子化合物，是開發(fā)腦部疾病藥物如腦瘤、精神障礙和神經(jīng)退行性疾病等有效的工具。

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縮寫：

AD：Alzheimer’s disease
OLIGs ：Oligodendrocyte genes
PIGs：Plaque-induced genes
Aβ：Amyloid β-protein
ST ：Spatial transcriptomics
TDs ：Tissue domains
App：Amyloid precursor protein
ENTI：Entorhinal area
ISS ：In situ sequencing
DAM ：Disease-associated microglia
ARM：Activated response microglia
 
原文閱讀：Wei-Ting Chen, et al. Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer's Disease. Cell. 2020 Jul 17;S0092-8674(20)30815-1.