一：主要研究?jī)?nèi)容

1、生物多樣性研究：
Thomsen等從丹麥的一個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)中采集海水，利用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)研究海洋魚(yú)類(lèi)生物多樣性。在獲得的環(huán)境DNA中發(fā)現(xiàn)了15種不同的魚(yú)類(lèi)，其中包括一些用傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法很難發(fā)現(xiàn)的稀有物種。同時(shí)與9種傳統(tǒng)的海洋魚(yú)類(lèi)調(diào)查方法比較，環(huán)境DNA檢測(cè)出的魚(yú)類(lèi)多樣性與其他傳統(tǒng)方法相當(dāng)，甚至優(yōu)于傳統(tǒng)方法。Thomsen等研究表明從湖泊、池塘和河流的少量水樣中直接獲得DNA，可以檢測(cè)并定量分析研究區(qū)域內(nèi)珍稀及瀕危淡水動(dòng)物(兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、哺乳類(lèi)、昆蟲(chóng)類(lèi)和甲殼類(lèi))多樣性。同時(shí)表明通過(guò)池塘水中分離的DNA，利用第二代測(cè)序技術(shù)可以檢測(cè)到研究區(qū)域內(nèi)兩棲類(lèi)和魚(yú)類(lèi)群體，環(huán)境DNA可以作為監(jiān)測(cè)珍稀瀕危物種的工具，應(yīng)用于更廣泛的物種監(jiān)測(cè)中。

應(yīng)用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)不僅可以針對(duì)當(dāng)前的生物多樣性進(jìn)行有效的評(píng)估，也可以對(duì)過(guò)去的動(dòng)植物群落的多樣性進(jìn)行評(píng)估。Epp等通過(guò)對(duì)過(guò)去和現(xiàn)在的環(huán)境DNA進(jìn)行metabarcoding研究，所有目標(biāo)類(lèi)群都能通過(guò)metabarcoding的方法檢測(cè)出來(lái)，但是類(lèi)群之間和不同年代的環(huán)境樣品所檢測(cè)的結(jié)果存在較大變異范圍。
目前國(guó)內(nèi)在應(yīng)用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)研究生物多樣性的報(bào)道還比較少。
 
2、外來(lái)入侵物種監(jiān)測(cè)：
目前外來(lái)入侵物種的情況日趨嚴(yán)重。當(dāng)外來(lái)物種入侵時(shí)，入侵物種很有可能破壞原本的生態(tài)平衡，使生態(tài)系統(tǒng)不完善，從而對(duì)本地物種的種類(lèi)和數(shù)量產(chǎn)生影響。但是在早期入侵階段外來(lái)入侵物種通常數(shù)量不多，使用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法耗時(shí)且效率不高，難度高，不能及時(shí)被發(fā)現(xiàn)。這會(huì)導(dǎo)致外來(lái)入侵物種對(duì)本地生態(tài)平衡的危害達(dá)到最高值時(shí)才受到重視，為時(shí)已晚。環(huán)境DNA metabarcoding增強(qiáng)了對(duì)入侵物種早期監(jiān)測(cè)的可能性，可以有效地遏制物種入侵。

研究發(fā)現(xiàn)利用環(huán)境DNA metabarcoding可以從淡水中提取環(huán)境DNA，檢測(cè)出外來(lái)入侵物種的存在。Ficetola等最早將環(huán)境DNA metabarcoding應(yīng)用于物種監(jiān)測(cè)，他們使用特異性引物擴(kuò)增短線粒體DNA序列追蹤在受控環(huán)境和自然環(huán)境中一種入侵牛蛙(Rana catesbeiana)的存在，發(fā)現(xiàn)對(duì)環(huán)境中低密度的物種，使用metabarcoding技術(shù)仍然可以進(jìn)行快速有效的物種檢測(cè)。這是首次結(jié)合大規(guī)模測(cè)序和DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展來(lái)進(jìn)行物種識(shí)別，為利用環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)外來(lái)物種提供了新方法和新思路。

Jerde等利用環(huán)境DNA研究美國(guó)芝加哥地區(qū)河流中的兩種入侵亞洲鯉科魚(yú)(Hypophthalmichthys molitrix和H.nobilis)，發(fā)現(xiàn)使用傳統(tǒng)電氣捕魚(yú)法檢測(cè)到一條魚(yú)需要93人的努力，而環(huán)境DNA metabarcoding方法檢測(cè)到目標(biāo)物種只需要0.174人d。在亞洲鯉科魚(yú)種群密度很低的區(qū)域，只有環(huán)境DNA方法能夠檢測(cè)到這兩種魚(yú)。

可見(jiàn)，環(huán)境DNA metabarcoding方法不僅在時(shí)間和資金成本上優(yōu)于傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法，而且可以在種群密度很低的環(huán)境樣本中靈敏地檢測(cè)到入侵物種的存在。

Piaggio等捕獲入侵佛羅里達(dá)州的半水棲物種緬甸巨蟒(Python bivittatus)，放置于90L的水箱中評(píng)估水中環(huán)境DNA的降解速率，結(jié)果表明緬甸巨蟒的DNA在96h以?xún)?nèi)都可以檢測(cè)到。在佛羅里達(dá)州6個(gè)野外地點(diǎn)采集的水樣中，有5個(gè)地點(diǎn)的緬甸巨蟒環(huán)境DNA為陽(yáng)性，這與緬甸巨蟒的野外分布結(jié)果一致。

Takahara等使用環(huán)境DNA方法采集日本海岸以及周?chē)鷯u嶼的70個(gè)水樣對(duì)一種入侵藍(lán)腮太陽(yáng)魚(yú)(Lepomis macrochirus)進(jìn)行檢測(cè)。利用藍(lán)腮太陽(yáng)魚(yú)的特異性引物(100bp的Cyt b片段)擴(kuò)增水環(huán)境DNA，結(jié)果表明70個(gè)池塘中有19個(gè)池塘遭受藍(lán)腮太陽(yáng)魚(yú)的入侵。盡管魚(yú)的大小、習(xí)性等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響，但使用環(huán)境DNA metabacoding提高了監(jiān)測(cè)入侵物種的準(zhǔn)確度。
 
3、稀有物種保護(hù)：
通過(guò)水體中的環(huán)境DNA可以有效檢測(cè)水生脊椎動(dòng)物，并且已在濕地和大型河流研究中得到證實(shí)。利用環(huán)境DNA檢測(cè)河流中的稀有物種和隱秘物種可以增加調(diào)查結(jié)果準(zhǔn)確性，減少調(diào)查成本。Goldberg等利用metabarcoding技術(shù)，通過(guò)收集快速流動(dòng)的水體環(huán)境DNA樣本，對(duì)尾突角蟾(Ascaphus montanus)和愛(ài)達(dá)荷陸巨螈(Dicamptodon aterrimus)兩種珍稀物種進(jìn)行監(jiān)測(cè)。設(shè)計(jì)特異性引物尾突角蟾和愛(ài)達(dá)荷陸巨螈的線粒體Cyt b區(qū)域的85bp和78bp片段，在5個(gè)不同物種密度的水樣中均成功進(jìn)行了PCR擴(kuò)增并靈敏地檢測(cè)到了目標(biāo)物種的存在。該研究還發(fā)現(xiàn)早春季節(jié)比早秋季節(jié)更難以檢測(cè)到兩棲類(lèi)物種存在，推測(cè)可能是由于早春比早秋溫度更低，降低了生物代謝速率而導(dǎo)致。

Foote等從海水中分離DNA，使用特異性引物擴(kuò)增線粒體DNA區(qū)域60—80bp的片段檢測(cè)水體中是否存在港灣鼠海豚(Phocoena phocoena)，對(duì)控制條件下和自然條件下該物種進(jìn)行遺傳監(jiān)測(cè)。在一個(gè)樣地中檢測(cè)到長(zhǎng)肢領(lǐng)航鯨(Globicephala melas)，而該物種極少在研究海域被發(fā)現(xiàn)，結(jié)果表明環(huán)境DNA的方法可用于檢測(cè)稀有物種。

Wilcox等利用環(huán)境DNA結(jié)合定量PCR檢測(cè)了河流中的兩個(gè)稀有物種，美洲紅點(diǎn)鮭(Salvelinus fontinalis)和強(qiáng)壯紅點(diǎn)鮭(S.confluentus)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)定量PCR(qPCR)比傳統(tǒng)PCR更加靈敏，檢測(cè)概率更高。Rees等利用環(huán)境DNA和傳統(tǒng)的實(shí)地調(diào)查方法開(kāi)展對(duì)英國(guó)珍稀保護(hù)物種冠北螈(Triturus cristatus)的監(jiān)測(cè)，野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)有冠北螈分布的地點(diǎn)中，采集的水樣DNA中成功檢測(cè)出冠北螈的概率為84%。使用環(huán)境DNA方法監(jiān)測(cè)物種，對(duì)物種及其生存環(huán)境不會(huì)造成損害。隨著測(cè)序成本的下降，環(huán)境DNA與metabarcoding技術(shù)結(jié)合應(yīng)用在許多情況下甚至優(yōu)于一些傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法，成為物種監(jiān)測(cè)方法的又一選擇。
 
4、一些補(bǔ)充說(shuō)明：
使用環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)水生生物時(shí)，必須保證能獲得該環(huán)境的完整樣品并能進(jìn)行很好的保存。水體的溫度和光照情況^，水體的流速，物種密度和在環(huán)境中的停留時(shí)間，生物體的發(fā)育階段等均會(huì)對(duì)環(huán)境中所取的DNA的量造成影響。

Maruyama等對(duì)水體中DNA的半衰期進(jìn)行了研究和計(jì)算，發(fā)現(xiàn)魚(yú)類(lèi)離開(kāi)此水體后環(huán)境DNA的半衰期是6.3h，但對(duì)環(huán)境DNA降解速率及其影響因素，環(huán)境DNA在環(huán)境中存在時(shí)間的長(zhǎng)短等問(wèn)題仍缺乏充分的了解。

在采集溪流水樣時(shí)，由于許多溪流水來(lái)自于地下水，所以接觸到目標(biāo)生物脫落DNA的可能性較低。此外，由于溪流水水位淺而且是充分混合的，因此脫落的DNA被光降解的可能性更大，導(dǎo)致在溪流中檢測(cè)到的目標(biāo)物種密度會(huì)比較低。使用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)對(duì)淡水中的物種進(jìn)行檢測(cè)已被證實(shí)快速有效。淡水中水流較平和且流量小，所以準(zhǔn)確度高。與淡水相比，海洋生態(tài)系統(tǒng)中有單位體積中的生物量比例更大，海流和波浪的影響作用，以及鹽度對(duì)保存和提取環(huán)境DNA的影響都需要加以考慮。這些因素可能意味著海水中的環(huán)境DNA不太集中，且分散更迅速，提取DNA時(shí)比較困難，導(dǎo)致在海水中使用時(shí)只能針對(duì)一小片區(qū)域，并且對(duì)外來(lái)入侵物種的檢測(cè)效率不高。因此在海水中的使用還需要進(jìn)一步的研究與完善。

二：水環(huán)境eDNA采樣設(shè)備

便攜式eDNA采樣器——上海蔚雨科技有限公司

多通道eDNA采樣器——上海蔚雨科技有限公司

設(shè)備優(yōu)勢(shì)
 
1、可記錄采樣點(diǎn)流速、GPS、溫度等信息
2、內(nèi)置計(jì)算機(jī)，可導(dǎo)出采樣日志、為每個(gè)樣品標(biāo)注采樣編碼
3、采樣飽和后具有震動(dòng)反饋功能，可設(shè)置定量采水
4、具備遠(yuǎn)程藍(lán)牙遙控采水功能
5、可進(jìn)行多通道的同步采樣
6、自封濾膜（技術(shù)）：采用合成樹(shù)脂材料自動(dòng)對(duì)樣本進(jìn)行脫水處理，使DNA信息能在室溫下保存90天不降解（傳統(tǒng)采樣方式需要對(duì)樣品進(jìn)行乙醇加注、冷凍、防腐等措施，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，往往會(huì)在采樣點(diǎn)浪費(fèi)大量時(shí)間）
①降低污染——傳統(tǒng)樣品處理方式需要現(xiàn)場(chǎng)對(duì)樣品進(jìn)行防腐處理，會(huì)增加污染可能。
②提高DNA含量——與傳統(tǒng)使用乙醇相比，檢測(cè)到的DNA含量是其2倍。
③提高效率——現(xiàn)場(chǎng)無(wú)需準(zhǔn)備乙醇及緩慢的過(guò)濾工作，無(wú)需準(zhǔn)備冷凍措施低溫保存樣品，即便是沒(méi)有相關(guān)從業(yè)經(jīng)驗(yàn)的人員即可快速上手實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的采樣工作。
 
設(shè)備標(biāo)配自封濾膜套裝self-preserving packs——封裝后即可郵寄至我司合作實(shí)驗(yàn)室分析

三：分析流程及結(jié)果

環(huán)境DNA提取——設(shè)計(jì)合成引物接頭——PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化——PCR產(chǎn)物定量均一化——測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建——高通量測(cè)序——生成報(bào)告

樣品報(bào)告包括但不限于：
 
1、物種多樣性統(tǒng)計(jì)
2、物種組成分析
3、群落比較分析
4、捕撈數(shù)據(jù)一致性分析