近年來，人們發(fā)現(xiàn)表觀遺傳上的修飾與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中m6A修飾作為RNA修飾中常見的修飾，在神經(jīng)系統(tǒng)中的研究也備受關(guān)注。近期云序客戶在Environmental Pollution期刊上發(fā)表了“Global N6-methyladenosine profiling of cobalt-exposed cortex and human neuroblastoma H4 cells presents epitranscriptomics alterations in neurodegenerative disease-associated genes”文章，運(yùn)用云序生物的m6A-MeRIP-seq和RNA-seq的技術(shù)闡明了CoCl2處理會顯著改變涉及突觸傳遞和中樞神經(jīng)發(fā)育通路的基因的m6A修飾和表達(dá)的變化。該結(jié)果為m6A修飾在環(huán)境中神經(jīng)毒物引起的神經(jīng)退行性損傷中的作用提供了新的見解，從而拓寬了人們對重金屬誘導(dǎo)RNA的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的理解。
 
發(fā)表期刊：Environmental Pollution
影響因子：6.792
研究方法：m6A- meRIP-seq、RNA-seq、qPCR
文章鏈接：Global N6-methyladenosine profiling of cobalt-exposed cortex and human neuroblastoma H4 cells presents epitranscriptomics alterations in neurodegenerative disease-associated genes

 

研究內(nèi)容
（1）CoCl2引起神經(jīng)系統(tǒng)的病理和神經(jīng)行為損傷
為了鑒定CoCl2會造成什么病理損傷，作者采用H&E染色法、Bielschowsky銀染和Nissl染色法檢測發(fā)現(xiàn)暴露于CoCl2后，皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少，神經(jīng)纖維纏結(jié)的數(shù)量增加，Nissl體減少。為進(jìn)一步鑒定CoCl2對神經(jīng)系統(tǒng)的影響，作者通過在小鼠中進(jìn)行Morris water maze評估發(fā)現(xiàn)隨著時間的增長，小鼠在CoCl2中逃跑的潛伏期逐漸縮短。此外，中、高劑量CoCl2組小鼠在目標(biāo)象限停留的時間更少，通過平臺的次數(shù)也明顯低于對照組。根據(jù)到達(dá)平臺所需的距離和到達(dá)次數(shù)間接反映小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，根據(jù)軌道圖可知神經(jīng)行為損傷的小鼠到達(dá)平臺的距離較長，到達(dá)平臺的次數(shù)較少。綜上可知，長時間暴露于CoCl2中會導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)和記憶障礙。
（2）GO和KEGG分析大腦皮層中受CoCl2影響的差異表達(dá)基因
通過RNA-seq發(fā)現(xiàn)在CoCl2中有339個基因表達(dá)水平發(fā)生了變化，其中188個基因表達(dá)上調(diào)，有151個基因表達(dá)下調(diào)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)差異上調(diào)基因主要富集于睡眠、視黃醇代謝、藥物代謝等方面；差異下調(diào)基因主要與代謝通路相關(guān)。GO分析表明，上調(diào)表達(dá)的基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生、氧結(jié)合等方面豐富；下調(diào)基因主要富集于多種代謝途徑。
（3）CoCl2導(dǎo)致了大腦皮層基因m6A修飾的改變
m6A 比色法 鑒定m6A修飾總體水平發(fā)現(xiàn)，與對照組相比暴露于CoCl2的小鼠皮質(zhì)內(nèi)的總RNA的m6A修飾水平顯著降低。使用m6A-MeRIP-seq顯示，與對照組相比CoCl2處理組中有4048個基因的m6A修飾發(fā)生改變，其中2446個基因m6A修飾增加，1602個基因m6A修飾減少。GO和KEGG通路分析用于鑒定差異甲基化基因，高甲基化基因主要參與胞吞、剪接、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸傳遞、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路而低甲基化基因主要富集于谷氨酸能、多巴胺能和GABA突觸相關(guān)性。此外有48個基因既發(fā)生m6A修飾又受CoCl2調(diào)控，這些基因參與了神經(jīng)元發(fā)育、細(xì)胞增殖和遷移途徑。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)CoCl2處理后有730個基因與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，其中418個基因m6A修飾增加，312個基因的m6A修飾減少。
（4）CoCl2誘導(dǎo)大腦皮層中m6A修飾和基因表達(dá)變化機(jī)制
為了研究CoCl2處理如何改變m6A修飾并影響了基因表達(dá)。作者通過WB和qRT-PCR檢測了去甲基酶(FTO和ALKBH5)和甲基轉(zhuǎn)移酶(METTLL3、METTL14和WTAP)分別在處理組和對照組表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FTO和ALKBH5蛋白和mRNA在處理組的表達(dá)水平增加，而METTL3、METTL14和WTAP蛋白和mRNA表達(dá)水平降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，CoCl2調(diào)控m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的表達(dá)水平，從而改變了m6A修飾和基因表達(dá)。
（5）H4細(xì)胞中m6A峰的差異分布
作者在H4細(xì)胞中進(jìn)行了m6A-MeRIP-seq，首先分析了所有m6A的motif分布，結(jié)果顯示對照組中有17290個的共有峰和9349個特異的m6A峰，在處理組中有14339個共有峰和9075獨(dú)特的m6A峰。根據(jù)6個細(xì)胞樣本中m6A峰的轉(zhuǎn)錄組分布，90%以上的峰位于基因區(qū)(5 ' -UTR、CDS、3 ' -UTR、內(nèi)含子、停止密碼子)，不到20%的峰位于基因區(qū)（5 ' -UTR區(qū)和3 '-UTR區(qū)），60%以上的峰位于CDS區(qū)。同時，超過23%的富集m6A峰包含GGACG序列。此外，m6A-MeRIP-seq數(shù)據(jù)中與對照組相比，共有8752個基因甲基化，其中3835個基因發(fā)生高甲基化，而4917個基因發(fā)生低甲基化。
（6）GO和KEGG通路分析CoCl2處理H4細(xì)胞后表達(dá)變化的基因的富集情況
利用RNA-seq在H4細(xì)胞中尋找CoCl2調(diào)控的基因，有218個基因在CoCl2處理后出現(xiàn)，其中205個基因下調(diào)，13個基因上調(diào)。通過GO分析，差異基因主要富集于金屬離子結(jié)合等方面；KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因在MAPK、HIF、腫瘤代謝以及凋亡、增殖和氧化相關(guān)通路中富集。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，有172個既發(fā)生了表達(dá)變化又有m6A修飾改變，167個高m6A修飾基因表達(dá)下調(diào)，5個低m6A修飾基因表達(dá)上調(diào)。對m6A修飾的氧化應(yīng)激相關(guān)基因qRT-PCR分析結(jié)果顯示PDK1、EGLN1、HO-1和VHL的表達(dá)在兩組間有顯著性差異。
（7）CoCl2改變了m6A的甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶從而調(diào)節(jié)RNA m6A甲基化
對H4細(xì)胞進(jìn)行不同濃度的CoCl2(100、400和600 mM)處理。用WB和qRT-PCR檢測去甲基化酶(FTO和ALKBH5）和甲基轉(zhuǎn)移酶(METTLL3, METTL14, WTAP)。結(jié)果證實(shí)CoCl2組中FTO、ALKBH5、METTL3、METTL14的表達(dá)水平下降，而WTAP蛋白表達(dá)水平升高。接下來，進(jìn)一步驗(yàn)證CoCl2是否會抑制m6A去甲基酶活性，作者用m6A去甲基化酶激活/抑制測定試劑盒檢測了CoCl2對m6A去甲基酶活性的影響。細(xì)胞暴露于不同的CoCl2 24h后，m6A去甲基化酶活性呈濃度依賴性下降。這些結(jié)果表明，CoCl2不僅調(diào)節(jié)m6A甲基化酶和去甲基化酶的表達(dá)，也降低了m6A去甲基化酶的活性，從而導(dǎo)致m6A甲基化改變。 文章點(diǎn)評
文章通過m6A-meRIP-Seq結(jié)合全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（云序提供），通過對測序結(jié)果比對分析確認(rèn)m6A甲基化修飾在CoCl2介導(dǎo)的神經(jīng)毒性中起著重要作用，文中結(jié)合這兩個測序結(jié)果取交集縮小差異范圍，明確檢測目標(biāo)。另外MeRIP-qPCR結(jié)合WB實(shí)驗(yàn)（云序提供），驗(yàn)證CoCl2處理可以降低m6A修飾酶和去甲基化酶的表達(dá)以改變受m6A甲基化調(diào)控的基因表達(dá)，從而導(dǎo)致一系列的生物學(xué)不良反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于我們更好地了解疾病的病因，而且為重金屬的治療模式提供了新的靶點(diǎn)。

云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-seq）
對m6A RNA甲基化，目前流行的檢測手段為m6A-Seq技術(shù)，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：

•  m6A 全轉(zhuǎn)錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
• m6A  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
• m6A  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
• m6A  mRNA測序
• m6A  miRNA測序

02 檢測整體m6A RNA修飾水平
 LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
準(zhǔn)確高效，可以實(shí)現(xiàn)一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法
快速檢測m6A整體甲基化水平

03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
 m6A RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m6A RNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。

04 m6A RNA修飾靶基因驗(yàn)證
 meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務(wù)，可針對mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類型的RNA分子進(jìn)行檢測，低通量驗(yàn)證RNA修飾靶基因表達(dá)水平。

05機(jī)制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗(yàn)證RNA修飾直接靶點(diǎn)，研究RNA修飾靶基因的調(diào)控機(jī)制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
5.3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)
驗(yàn)證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。

 

云序生物服務(wù)優(yōu)勢
優(yōu)勢一：發(fā)表10分以上文章多的m6A RNA甲基化測序服務(wù)平臺。云序已累計(jì)支持客戶發(fā)表36篇高水平文章，合計(jì)影響因子232分，是國內(nèi)支持發(fā)文多、累計(jì)影響因子高的公司。
優(yōu)勢二：檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA, Pri-miRNA等）。
優(yōu)勢三：提供m6A一站式服務(wù)：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗(yàn)證、RIP和RNA pull-down等。 
優(yōu)勢四：率先研發(fā)超微量MeRIP測序技術(shù)，RNA量低至500ng起。
優(yōu)勢五： 國內(nèi)RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、ac4C乙�；�和2'-O-甲基化測序。

 

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