使用熒光探針的質(zhì)膜染色技術(shù)

 

       真核細(xì)胞質(zhì)膜（PM）是脂質(zhì)雙層，組織成一個(gè)連續(xù)的屏障，將細(xì)胞環(huán)境與細(xì)胞外空間分隔開, 由質(zhì)膜提供的物理屏障還用作蛋白質(zhì)的生物支架，這些蛋白質(zhì)介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或引發(fā)細(xì)胞響應(yīng)（例如Ras 1），以響應(yīng)細(xì)胞表面發(fā)生的細(xì)胞外事件。除了這些功能，PM還通過釋放和接收被稱為細(xì)胞外囊泡（EVs）2的封裝生物分子，充當(dāng)細(xì)胞間樞紐。質(zhì)膜的諸多重要作用，使得通過熒光標(biāo)記質(zhì)膜來研究質(zhì)膜功能變得越來越普遍。

 

今天給大家總結(jié)一下常用熒光膜探針的優(yōu)缺點(diǎn)，并概述了最新膜探針突破，發(fā)光膜探針通過結(jié)合在質(zhì)膜附近或質(zhì)膜內(nèi)來描繪細(xì)胞的外圍。平常我們用的最多的有五類膜探針：小麥胚芽凝集素（WGA）偶聯(lián)物，脂質(zhì)偶聯(lián)物，親脂性染料，共價(jià)結(jié)合探針和生物物理報(bào)告探針，下面我們來對(duì)這五種常見探針做一個(gè)簡(jiǎn)要介紹：

 

       1. 小麥胚芽凝集素（WGA）

 

       WGA是一種凝集素，可優(yōu)先結(jié)合細(xì)胞表面聚糖N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰神經(jīng)氨酸。這些碳水化合物通常附著在蛋白質(zhì)上，它們的定位可間接顯示細(xì)胞膜。現(xiàn)在，目前WGA標(biāo)記物利用Alexa Fluor綴合技術(shù)，可以對(duì)細(xì)胞表面多糖標(biāo)記物進(jìn)行定位，從而使科學(xué)家能夠間接檢測(cè)質(zhì)膜。熒光團(tuán)偶聯(lián)的WGA探針也有顯著缺點(diǎn)：表面多糖可以隨細(xì)胞膜的組成而變化，從而在特定的細(xì)胞群體之間導(dǎo)致細(xì)胞間染色差異。此外，偶聯(lián)的WGA由于其較大尺寸限制了其擴(kuò)散，因此無法有效地染色3D培養(yǎng)細(xì)胞和組織。

 

       2. PKH

 

       PKH染料具有碳鏈，該碳鏈將熒光團(tuán)插入并錨定在質(zhì)膜的脂質(zhì)區(qū)域，PKH染料可標(biāo)記活細(xì)胞中的質(zhì)膜，據(jù)報(bào)道其半衰期為5-100天，染色的必需配有專們等滲試劑�；ㄇ郟aul Karl Horan（PKH）染料的化學(xué)作用使質(zhì)膜的特定標(biāo)記成為可能，而無需膜表達(dá)因子。當(dāng)前，由PKH2，PKH26和PKH67組成的可用PKH染料具有從504 nm到567 nm的有限發(fā)射光譜，插入染料后，需要通過添加血清或BSA蛋白來完成染料淬滅步驟，無法淬滅未結(jié)合的染料會(huì)導(dǎo)致染料聚集并進(jìn)入共培養(yǎng)或?qū)е录?xì)胞結(jié)塊。相關(guān)最新研究數(shù)據(jù)表明，用PKH26標(biāo)記會(huì)引起外泌體腫脹，這可能會(huì)改變外泌體的正常分布和細(xì)胞攝取。通常，由于不良的水溶性，PKH標(biāo)記效率低，需要相對(duì)較高的濃度來實(shí)現(xiàn)有效的膜染色。

 

       3. 長(zhǎng)鏈花青染料

 

       長(zhǎng)鏈親脂性花青染料DiI，DiD，DiA，DiR和DiO是眾所周知的質(zhì)膜染料，涵蓋了廣泛的激發(fā)/發(fā)射光譜。DiO； DiOC 18（3））在501 nm處出現(xiàn)熒光峰，DiI在565 nm處峰，4- Di -10- ASP在590nm處，DiD在665nm處， DiR '; DiIC 18（7））在780nm處達(dá)到峰值。盡管這些碳花青染料廣泛覆蓋可見光譜范圍，但它們實(shí)際上不溶于水。因此，它們?cè)谒�溶液中�?qiáng)烈聚集，產(chǎn)生難以控制的細(xì)胞膜染色。例如，DiO無法對(duì)DiA成功染色的組織染色，而DiI可以有效地標(biāo)記膜，但是遠(yuǎn)紅外DiD會(huì)產(chǎn)生點(diǎn)狀染色。同時(shí)在需要Triton-X 100來增加細(xì)胞通透性的共標(biāo)記應(yīng)用中，花青染料也不兼容。

 

       4. MemGlow™探針

 

 

用MemGlow™探針標(biāo)記的活HeLa細(xì)胞. 圖片由Mayeul Collot等提供. 2019.

 

       MemGlow™系列探針（圖1）提供了一種新的磷脂膜染色解決方案，它由5種基于熒光花青的質(zhì)膜探針組成，具有寬光譜范圍，包括近紅外（Ex: 499-689 nm，Em: 506-713nm）3。

 

       MemGlow™探針具有其原始花青或BODIPY母體染料的許多優(yōu)秀的特性，同時(shí)在某些應(yīng)用中顯示出比同類產(chǎn)品更高的標(biāo)記效率。MemGlow™560和640探針的優(yōu)點(diǎn)是基于花菁對(duì)稱的化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過兩個(gè)兩性離子錨的化學(xué)連接進(jìn)一步增強(qiáng)了這些結(jié)構(gòu)。類似地，MemGlow™488是一種兩親性調(diào)節(jié)的BODIPY探針，通過添加兩性離子錨來增強(qiáng)，以提高對(duì)細(xì)胞膜的特異性，使其超過了親本BODIPY染料。兩性離子錨促進(jìn)了探針聚集體在質(zhì)膜中的解離和嵌入，同時(shí)增強(qiáng)了它們的保留能力（圖2）。

 

 

       圖2. MemGlow™探針的開啟機(jī)制. MemGlow™探針是自淬滅的，直到插入質(zhì)膜才能使納米粒子激發(fā)熒光。

 

       MemGlow™應(yīng)用程序很簡(jiǎn)單,當(dāng)將MemGlow™探針引入水性介質(zhì)中時(shí)，兩親性探針會(huì)形成自發(fā)淬滅性的聚集體，直到與質(zhì)膜的接觸引發(fā)其解離并分散到脂質(zhì)雙層中。整合后，熒光探針即可進(jìn)行生物成像。從MemGlow™488到MemGlow™700，MemGlow™探針產(chǎn)生的信噪比分別為20和3.4，分別之間的背景和顯示出的信號(hào)與背景的比值（S / B）強(qiáng)烈的熒光大許多倍。MemGlow™探針是一項(xiàng)技術(shù)突破，優(yōu)于許多現(xiàn)代染色劑，MemGlow™標(biāo)記非常高效，甚至納摩爾濃度也可以顯示細(xì)胞間絲狀偽足和納米管（圖3A和3B）。

 

 

       圖3A. 用MemGlow 488™染色并通過激光掃描共聚焦顯微鏡成像的細(xì)胞的3D重建. 用50 nM MemGlow™488染色的KB活細(xì)胞5分鐘，無需清洗即可成像. 細(xì)胞間絲狀偽足和納米管在細(xì)胞之間可見（白色箭頭）.   圖像偽彩色為橙色. 圖片由Mayeul Collot等提供. 2019.

 

 

       圖3B. 用20 nM MemGlow™488標(biāo)記并通過激光掃描共聚焦顯微鏡成像的活KB細(xì)胞的質(zhì)膜. 整個(gè)細(xì)胞之間可見細(xì)胞間絲狀偽足和納米管（白色箭頭）. 圖片由Mayeul Collot等提供. 2019.

 

       是什么使MemGlow™成為膜標(biāo)記領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)者？

 

       產(chǎn)品推薦：
 

名稱	貨號(hào)
MemGlow™ 488: Fluorogenic Membrane Probe (a member of the MEMBRIGHT™ family)	MG01
MemGlow™ 560: Fluorogenic Membrane Probe (a member of the MEMBRIGHT™ family)	MG02
MemGlow™ 640: Fluorogenic Membrane Probe (a member of the MEMBRIGHT™ family)	MG04

 

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