去甲基化酶ALKBH5在胰腺癌中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：1372　發(fā)布日期：2020-7-9　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

文章導(dǎo)讀

表觀遺傳修飾如m6A甲基化在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。而甲基化酶對(duì)ai癥的影響也受到廣泛關(guān)注。其中去甲基化酶ALKBH5已被報(bào)道過能通過維持乳腺ai細(xì)胞的干細(xì)胞性而促進(jìn)腫瘤的形成，還有文章探究過其在急性白血病中的作用，但其對(duì)胰腺ai的影響還缺乏研究。今年5月份發(fā)表在Molecular Cancer (IF=15) 上的文章RNA demethylase ALKBH5 prevents pancreatic cancer progression by posttranscriptional activation of PER1 in an m6A-YTHDF2-dependent manner揭示了去甲基化酶ALKBH5通過調(diào)控m6A修飾調(diào)節(jié)PER1的轉(zhuǎn)錄后激活，發(fā)揮對(duì)胰腺ai抑制作用。

RNA demethylase ALKBH5 prevents pancreatic cancer progression by posttranscriptional activation of PER1 in an m6A-YTHDF2-dependent manner

發(fā)表期刊：Molecular Cancer
影響因子：15.302
發(fā)表時(shí)間：2020.5.19
實(shí)驗(yàn)方法: m6A-seq, RNA-seq,MeRIP-qPCR, ChIP, CoIP, 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)
文章鏈接：RNA demethylase ALKBH5 prevents pancreatic cancer progression by posttranscriptional activation of PER1 in an m6A-YTHDF2-dependent manner

研究內(nèi)容
1.ALKBH5降低對(duì)胰腺ai的指示意義
首先為了探究去甲基化酶ALKBH5在胰腺ai中的表達(dá)和臨床意義，作者對(duì)42個(gè)胰腺ai患者的腫瘤和臨近組織做了qPCR和免疫染色，發(fā)現(xiàn)腫瘤中ALKBH5的表達(dá)明顯降低，mRNA的m6A水平升高。加上對(duì)數(shù)據(jù)庫中177個(gè)胰腺ai患者生存率的分析發(fā)現(xiàn) ALKBH5低表達(dá)與總生存率的降低具有相關(guān)性。這些結(jié)果初步顯示了ALKBH5表達(dá)對(duì)胰腺ai的預(yù)測和預(yù)后具有指示意義。

2.ALKBH5降低對(duì)胰腺ai細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平的影響
接著，作者對(duì)3個(gè)過表達(dá)ALKBH5的胰腺ai細(xì)胞樣品和3個(gè)對(duì)照胰腺ai細(xì)胞樣品進(jìn)行了RNA-seq（云序提供服務(wù)），發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的ALKBH5的細(xì)胞中，前15個(gè)上調(diào)基因包括了 PER1, FOXO1, CDC20, 和CCR5等，GO分析顯示上調(diào)的基因富集在細(xì)胞周期終止、抗增殖和細(xì)胞凋亡等功能，而下調(diào)的基因富集在細(xì)胞增殖和存活相關(guān)功能條目中，KEGG分析顯示富集的通路中含有細(xì)胞周期和生長的相關(guān)的通路p53信號(hào)通路和 PI3K-AKT信號(hào)通路。這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示ALKBH5具有抑制胰腺ai的功能。

3.ALKBH5抑制胰腺ai細(xì)胞增殖、遷移和侵襲
作者通過細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證ALKBH5對(duì)胰腺ai細(xì)胞的影響。通過轉(zhuǎn)染手段，發(fā)現(xiàn)對(duì)胰腺ai細(xì)胞進(jìn)行ALKBH5過表達(dá)能導(dǎo)致細(xì)胞增值降低，而敲降A(chǔ)LKBH5會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增值速率上升。細(xì)胞群落形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀分析顯示了相同結(jié)果。并且過表達(dá)ALKBH5抑制傷口閉合和ai細(xì)胞侵襲能力。

4.ALKBH5抑制胰腺ai細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移
將過表達(dá)ALKBH5的ai細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ALKBH5的ai細(xì)胞生成的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，并且細(xì)胞生長的指示分子Ki-67的表達(dá)也明顯降低。染色顯示過表達(dá)ALKBH5的組織中侵襲和轉(zhuǎn)移的指示分子MMP-2和MMP-9表達(dá)降低，敲降A(chǔ)LKBH5的組織中兩分子則升高。原位和異種移植模型中都得到了相似的結(jié)果。

5.ALKBH5作用于PER1調(diào)控胰腺ai細(xì)胞
作者通過ELISA發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ALKBH5的細(xì)胞中m6A整體水平下降。于是通過m6A-seq（云序提供服務(wù)）進(jìn)一步尋找去甲基化酶可能作用的靶基因。比較過表達(dá)ALKBH5的細(xì)胞，對(duì)照細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了7226個(gè)特有的甲基化位點(diǎn)，其中應(yīng)含有ALKBH5作用的基因。通過對(duì)RNA-seq和m6A-seq（云序提供服務(wù)）兩組學(xué)聯(lián)合分析，篩選出78個(gè)表達(dá)和甲基化水平都明顯差異的基因，再與7226個(gè)對(duì)照組特有甲基化位點(diǎn)所在的基因取交集，篩選出9個(gè)基因。再結(jié)合可視化，鎖定了3’UTR區(qū)有明顯m6A峰的基因PER1。

6.缺少ALKBH5引發(fā)m6A識(shí)別蛋白YTHDF2誘導(dǎo)的mRNA降解，導(dǎo)致PER1的mRNA水平降低
qPCR顯示ALKBH5過表達(dá)細(xì)胞中PER1表達(dá)升高，ALKBH5敲降細(xì)胞中PER1表達(dá)降低, 表明ALKBH5可調(diào)控PER1表達(dá)。MeRIP-qPCR（云序提供服務(wù)）則驗(yàn)證了過表達(dá)ALKBH5降低PER1的m6A水平。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)（云序提供服務(wù)）進(jìn)一步驗(yàn)證了ALKBH5作用在mRNA上的motif序列并能調(diào)控PER1的表達(dá)水平。另外由于PER1 mRNA上m6A位點(diǎn)與識(shí)別蛋白YTHDF2的結(jié)合位點(diǎn)臨近，作者進(jìn)行了敲降實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲降YTHDF2也能導(dǎo)致PER1 mRNA水平升高。這些結(jié)果表明，ALKBH5的敲降，導(dǎo)致PER1 mRNA的m6A水平升高，進(jìn)而被YTHDF2識(shí)別增強(qiáng)了mRNA降解。

7.PER1抑制胰腺ai細(xì)胞
為了驗(yàn)證PER1對(duì)胰腺ai的影響，作者首先通過qPCR驗(yàn)證了42個(gè)患者的腫瘤組織中PER1表達(dá)降低。生存分析顯示PER1低表達(dá)和總生存率的降低有相關(guān)性，并且對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的分析表明PER1表達(dá)與ALKBH5水平正相關(guān)。CCK-8, EdU 和 transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PER1異位表達(dá)可抑制胰腺ai進(jìn)展，并部分緩解ALKBH5敲降帶來的細(xì)胞增值和侵襲。另外，作者還發(fā)現(xiàn)了回補(bǔ)PER1表達(dá)導(dǎo)致 ATM依賴信號(hào)通路的重激活，包括p-ATM, p-CHK2, p-CDC25C, p-P53, P21,和p-CDK表達(dá)的上升。CoIP（云序提供服務(wù)）實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了ATM和PER1的相互作用。

8.PER1誘導(dǎo)恢復(fù)P53表達(dá)增強(qiáng)ALKBH5轉(zhuǎn)錄
作者發(fā)現(xiàn)PER1過表達(dá)引起P53升高后，ALKBH5水平也隨之升高，同時(shí)免疫染色也顯示整體m6A水平降低。于是為了驗(yàn)證P53和ALKBH5的關(guān)系，通過ChIP實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)（云序提供服務(wù)），驗(yàn)證了P53與ALKBH5的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，激活A(yù)LKBH5的轉(zhuǎn)錄。

總結(jié)
本文作者通過RNA-seq, m6A-seq, MeRIP-qPCR, ChIP, CoIP,雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)等方法，研究發(fā)現(xiàn)去甲基化酶ALKBH5缺失會(huì)加重胰腺ai的發(fā)生和不良臨床病理表現(xiàn)特征。ALKBH5的過度表達(dá)可降低了體外腫瘤的增殖、遷移和侵襲活性，改善了體內(nèi)腫瘤生長，而ALKBH5基因敲除可促進(jìn)胰腺ai的進(jìn)展。其調(diào)控機(jī)制為，ALKBH5調(diào)控m6A去甲基化，減少YTHDF2識(shí)別m6A導(dǎo)致的mRNA降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上激活PER1，PER1上調(diào)導(dǎo)致ATM-CHK2-P53/CDC25C信號(hào)的激活，抑制細(xì)胞生長。而P53誘導(dǎo)的ALKBH5轉(zhuǎn)錄激活又是對(duì)m6A修飾的反饋調(diào)節(jié)。本研究為基于去甲基化的胰腺ai診斷和治療方法提供了基礎(chǔ)。

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