文章導(dǎo)讀

2020年3月20日，云序客戶上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院田聆教授課題組在高分期刊Moleular Cancer雜志（影響因子10.679）發(fā)表了關(guān)于外泌體在胰腺癌腫瘤再生長中的研究。腫瘤再生長是放射治療失敗的主要原因。以往的研究表明，死亡的腫瘤細胞通過促進殘留的腫瘤再生細胞(TrCs)的增殖，在腫瘤再增殖過程中起著至關(guān)重要的作用。然而，TRCs在放療后也會遭受DNA損傷，并可能在垂死細胞釋放的增殖因子的刺激下發(fā)生有絲分裂錯誤。因此，本研究打算找出這些自相矛盾的生物學(xué)過程是如何發(fā)生的，以降低放療后腫瘤的再增殖可能。接下來，小編就帶大家一起解讀這篇高分文章。

發(fā)表期刊：Mol. Cancer
影響因子：10.679
發(fā)表日期：20200320
實驗方法：全轉(zhuǎn)錄組測序、外泌體miRNA測序（云序提供測序服務(wù)）
文獻鏈接：Dying tumor cell-derived exosomal miR-194-5p potentiates survival and repopulation of tumor repopulating cells upon radiotherapy in pancreatic cancer

 文章內(nèi)容
（1）受輻射的垂死腫瘤細胞釋放的外泌體可動態(tài)增強腫瘤的繁殖
首先作者通過相關(guān)研究證明受輻射的垂死腫瘤細胞分泌的外泌體在輻射后期會促進增殖。為了弄清原理，作者對輻射前后的胰腺癌細胞進行了全轉(zhuǎn)錄組測序（本實驗云序提供）。并進行了GO分析，發(fā)現(xiàn)差異基因多富集在與細胞外囊泡和外泌體調(diào)控有關(guān)的條目中（圖1a）。接著作者進一步研究發(fā)現(xiàn)，與未輻照的胰腺癌細胞相比，輻照過的胰腺癌細胞的外泌體釋放量增加（圖1b）。為了驗證外泌體在存活的腫瘤細胞中的直接作用，作者在體外進行了菌落形成試驗。放射后，用垂死的腫瘤細胞來源的外泌體處理的癌細胞的集落形成能力顯著增強（圖1g）。結(jié)果表明，來自垂死的腫瘤細胞的外泌體可以促進放射后的細胞存活。
作者進一步探討了外泌體對胰腺癌的作用，作者在胰腺癌異種移植（PDX）小鼠模型中進行了體內(nèi)實驗。發(fā)現(xiàn)輻照的PDX腫瘤能加速種群重現(xiàn)（圖1h）。當(dāng)PDX小鼠同時用GW4869（外泌體抑制劑）治療時，腫瘤的種群顯著減慢（圖1h），小鼠的生存時間延長了（圖1i）。這些結(jié)果表明，垂死的腫瘤細胞來源的外泌體促進了腫瘤的重新聚集。

（2）垂死的腫瘤細胞釋放的外泌體增強了ALDH1A1+ TRC的存活
作者認(rèn)為腫瘤再生細胞（TRC）可能是外泌體的主要受體。由于目前沒有辦法鑒定TRC，因此作者收集了放射后存活的胰腺癌細胞，并通過高通量測序分析了癌癥干細胞相關(guān)基因的表達譜。發(fā)現(xiàn)與未輻射的對照組相比，有62個基因表達被上調(diào)， 值得注意的是，輻射后ALDH1A1的表達顯著上調(diào)（圖2a）。眾所周知，ALDH1A1是胰腺癌干樣細胞重要的標(biāo)志物之一。ALDEFLOUR™實驗表明，放射后存活的癌細胞和原發(fā)性胰腺腫瘤細胞中ALDH +細胞的比例顯著提高（圖2b-c）。qPCR分析和Western印跡表明，ALDH1A1的表達在受輻照的胰腺癌細胞和PDX腫瘤組織中表達上調(diào)（圖2d）。免疫組織化學(xué)（IHC）染色進一步顯示，ALDH1A1+細胞在PDX腫瘤組織中照射后高度富集（圖2e）。但是，GW4869顯著抑制了ALDH1A1+細胞的積累（圖2e），這表明外泌體可能會促進ALDH1A1 +細胞的存活。
此外，作者檢查了垂死的腫瘤細胞對TRC的直接保護作用。當(dāng)與受輻照的胰腺癌細胞共培養(yǎng)后，受輻照的細胞表現(xiàn)出明顯更高的存活率（圖2g-h）。如圖所示，輻射細胞分離的外泌體顯著提高了細胞的存活率（圖2h）。以上結(jié)果表明，在放療中垂死腫瘤細胞分泌的外泌體能提高ALDH1A1+ TRC的存活率。

（3）外泌體通過促進DNA損傷反應(yīng)增強TRC的存活
接著，作者探討了垂死的腫瘤細胞分泌的外泌體如何促進ALDH1A1+細胞的存活。H＆E染色顯示，PDX腫瘤中的細胞在放射后14天呈現(xiàn)出較大的核，并具有明顯的異質(zhì)性（圖3a），這表明了放射損傷的積累。輻射后50天，細胞恢復(fù)了活力，并恢復(fù)了“正常”的細胞核形態(tài)。但是，GW4869處理后阻礙了腫瘤細胞的恢復(fù)（圖3a）。值得注意的是，ALDH1A1+和γH2A.X雙重染色表明，輻射后，ALDH1A1+細胞也遭受了DNA損傷（圖3b）。在GW4869治療組中，大多數(shù)ALDH1A1+細胞在放射后50天仍顯示出明顯的γH2A.X陽性灶（圖3b）。這些數(shù)據(jù)表明，輻射后TRC的存活涉及DNA損傷反應(yīng)（DDR），該損傷由受輻射的垂死腫瘤細胞的外泌體調(diào)節(jié)。
此外，作者還探究了外泌體是否能直接促進體外輻射存活TRC的DDR。如示蹤細胞所示，輻射在ALDH1A1+和ALDH1A1-細胞中均引起DNA損傷（圖3c）。GW4869顯著損害了ALDH1A1+細胞的修復(fù)，因為它們中的大多數(shù)在放射后3天仍攜帶γH2A.X陽性灶（圖3c）。此外，來自輻射的垂死腫瘤細胞的外泌體顯著加速了γ-H2A.X和pATM的衰減（圖3d）并降低了輻射細胞中DNA損傷（圖3e）。總體而言，這些結(jié)果表明，受輻射的垂死的腫瘤細胞來源的外泌體通過促進DDR增強了TRC的存活。

（4）外泌體miR-194-5p促進受損TRC的修復(fù)
作為外泌體的重要內(nèi)含物，作者推斷miRNAs可能在TRC的存活中起重要作用。因此，作者進行了對輻射前后的腫瘤細胞外泌體進行了外泌體miRNA測序（本實驗云序提供），發(fā)現(xiàn)在垂死的腫瘤細胞來源的外泌體中，兩個重要的miRNA，即miR-196b-5p和miR 194-5p顯著上調(diào)（圖4a）。前人研究表明，miR-194可能參與基因組穩(wěn)定性。因此，作者將其作為目標(biāo)分子，通過qPCR分析驗證了miR-194-5p在外泌體中的高表達（圖4b）。同樣，miR-194-5p mimics轉(zhuǎn)染的細胞在輻射后具有更強大的集落形成能力（圖4d）。此外，當(dāng)使用強力霉素處理時，胰腺癌細胞的集落形成被顯著抑制。但是，如果強力霉素誘導(dǎo)后的胰腺癌細胞暴露于輻射中，則這些細胞的集落形成將顯著增強（圖4e）。此外，miR-194-5p mimics在輻射的胰腺癌細胞中顯著促進了γH2A.X和pATM的衰減（圖4f）和DNA損傷的減少。這些結(jié)果表明，外泌體miR-194-5p通過促進DDR促進了TRC的存活。
為了進一步確定miR-194-5p的主要有效靶標(biāo)，作者首先預(yù)測了它的靶基因，并對預(yù)測結(jié)果進行KEGG分析，預(yù)測目標(biāo)中只有轉(zhuǎn)錄因子E2F3與細胞周期調(diào)控有關(guān)。E2F3是E2F家族的一員，已被廣泛發(fā)現(xiàn)可促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展。于是作者用雙重?zé)晒馑孛笀蟾婊�因檢測證明E2F3是miR-194-5p的直接靶標(biāo)（圖4g）。與miR-194-5p相反，E2F3過表達促進細胞周期進程和EdU摻入，并阻礙pATM和γH2A.X的衰減（圖4h）并減少受輻照的胰腺癌細胞中DNA的損傷。E2F3基因敲除提高了放射后胰腺癌細胞的集落形成能力，而miR-194-5p mimics的轉(zhuǎn)染并沒有進一步增強該能力（圖4i）。這些數(shù)據(jù)表明外泌體miR-194-5p抑制E2F3誘導(dǎo)G1 / S阻滯并促進DNA損傷修復(fù)。
先前的研究確定HMGA2和E2F3是胰腺癌的八個主要調(diào)節(jié)樞紐中的兩個，  作者發(fā)現(xiàn)HMGA2負(fù)調(diào)控miR-194-5p的表達（圖4j），并通過一系列實驗證明，HMGA2富含莖狀A(yù)LDH1A1+細胞，并且有助于胰腺癌的進展。但是，當(dāng)胰腺癌細胞暴露于10Gy輻射時，HMGA2的過表達顯著抑制了這些細胞的集落形成能力（圖4k），而敲除HMGA2則增強了細胞存活和集落形成（圖4l）。HMGA2還阻礙了輻射的胰腺癌細胞中pATM和γH2A.X的衰減（圖4m）和DNA損傷�？傊�，這些數(shù)據(jù)表明，TRC中富集的HMGA2促進了干細胞的生長和癌癥進展，但潛在地?fù)p害了輻射的TRC的存活和恢復(fù)，而來自垂死的腫瘤細胞的外泌體miR-194-5p瞬時逆轉(zhuǎn)了輻射下HMGA2的作用。

（5）垂死的腫瘤細胞釋放的PGE2促進TRC的增殖
如前所述，垂死的腫瘤細胞能促進報告細胞的增殖，這暗示著TRCs被除了外泌體miR-194以外的物質(zhì)驅(qū)使加速了增殖。眾所周知，受輻射的垂死腫瘤細胞還釋放了PGE2，這是一種脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是化學(xué)放療后腫瘤重生的重要介質(zhì)。因此，作者通過ELISA定量了受輻射的垂死胰腺癌細胞中的PGE2，發(fā)現(xiàn)放射后24小時PGE2含量保持不變，但在48小時略有升高，而在72小時顯著增加（圖5a）。
同樣，PGE2形成的關(guān)鍵酶PTGS2（COX-2）的表達也經(jīng)歷了短暫的滯后階段，之后逐漸增加（圖5b-c）。而輻射后，胰腺癌細胞中，外泌體相關(guān)蛋白（如RAB27A，TSG101和CD9）的表達立即增加（圖5c）。值得注意的是，當(dāng)COX-2的表達逐漸增加時，外泌體相關(guān)蛋白的表達減少（圖5c）。在PDX小鼠模型中，IHC染色還顯示，放射后不久，外泌體相關(guān)蛋白的表達升高，直到12天后下降，此時COX 2的表達開始顯著上調(diào)（圖5d）。
同時，發(fā)現(xiàn) celecoxib（一種抑制PGE2合成的COX-2抑制劑）以劑量依賴性方式顯著抑制了腫瘤細胞的繁殖（圖5e）。雖然PGE2可以加速腫瘤細胞的增殖，但是在放射后立即向腫瘤細胞中添加PGE2會反向抑制細胞活力（圖5f）。值得注意的是，celecoxib處理并不會影響外泌體相關(guān)標(biāo)志蛋白質(zhì)的表達（圖5g）。這些結(jié)果表明，輻射的垂死腫瘤細胞分泌的外泌體對于腫瘤的再形成至關(guān)重要。
綜上，這些結(jié)果表明，垂死的腫瘤細胞釋放的外泌體和PGE2共同作用導(dǎo)致了腫瘤的再增殖級聯(lián)反應(yīng)，其中外泌體miR-194-5p首先抑制細胞增殖以促進TRC的恢復(fù)，然后PGE2促進TRC的加速增殖。

（6）阿司匹林通過削弱垂死的腫瘤細胞的分泌物來抑制放療后的腫瘤
作者前期研究推測，阿司匹林可能具有抑制胰腺癌中腫瘤再增殖的潛力，前人研究也表名其會影響外泌體和miRNA。因此，作者首先在體外測試了阿司匹林治療在腫瘤細胞重塑模型中的作用。發(fā)現(xiàn)阿司匹林極大地抑制了與輻射的垂死腫瘤細胞共培養(yǎng)的報告細胞的增殖（圖6a），而當(dāng)它們單獨培養(yǎng)時對報告細胞的增殖沒有影響。阿司匹林降低了輻射的胰腺癌細胞上清液中的PGE2含量（圖6b），并減少了細胞釋放的外泌體的量（圖6c）。此外，在阿司匹林處理過的輻射細胞衍生的外泌體中，miR-194-5p被下調(diào)（圖6d）。與僅接受放射線處理的細胞分泌的外泌體相比，經(jīng)阿司匹林處理的輻射細胞衍生的外泌體喪失了誘導(dǎo)G1 / S阻滯并減少EdU摻入的能力（圖6e-f）。因此，經(jīng)阿司匹林處理的輻射細胞產(chǎn)生的外泌體在輻射后不能促進胰腺癌細胞的集落形成（圖6g）。
接著，作者又在PDX小鼠模型中測試了阿司匹林治療的效果。阿司匹林單一療法對PDX腫瘤無治療作用，單獨放療同樣無治療作用（圖6h-i）。然而，阿司匹林治療和放射療法的結(jié)合顯著抑制了腫瘤的重新聚集并延長了荷瘤小鼠的存活時間（圖6h-i）。此外，阿司匹林損害了放療后腫瘤組織的恢復(fù)，這與GW4869的作用相似。同時，阿司匹林還抑制了放療后腫瘤組織中ALDH1A1+ TRC的富集。這些數(shù)據(jù)表明，阿司匹林可抑制胰腺癌放療后的腫瘤再增殖。

總結(jié)

總的來說，本研究通過全轉(zhuǎn)錄組測序（云序提供）和外泌體miRNA測序（云序提供），鑒定顯著變化的miRNAs。并采用qPCR、Western blot、IHC、FACS、集落形成等實驗進行分子和細胞分析，發(fā)現(xiàn)垂死腫瘤細胞來源的外泌體通過傳遞miR-194-5p誘導(dǎo)G1/S期阻滯，促進DNA損傷反應(yīng)，提高TRCs的存活率，進而調(diào)節(jié)E2F3的表達。此外，外泌體miR-194-5P可減輕放療時致癌HMGA2的毒副作用。在潛伏一段時間后，垂死的腫瘤細胞進一步釋放大量的PGE2來恢復(fù)TRCs的增殖，并協(xié)調(diào)了再增殖的級聯(lián)反應(yīng)。值得注意的是，該研究發(fā)現(xiàn)小劑量阿司匹林可以通過抑制外泌體和PGE2的分泌來抑制胰腺癌放療后的再生長。

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