2020年1月31日，m6A調(diào)節(jié)睪酮合成一文發(fā)表在Autophagy （IF=11.059）期刊上，該文章采用多組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用技術(shù)檢測睪丸間質(zhì)細(xì)胞（LCs）m6A甲基化修飾，這項研究揭示m6A 甲基化在LCs中調(diào)節(jié)睪酮合成中的作用，通過利用m6A 甲基化研究作為無精子癥和少精子癥的治療靶點(diǎn)，為新的治療策略提供了方向。

發(fā)表期刊：Autophagy
影響因子：11.059
發(fā)表時間：20200131
實(shí)驗方法：MeRIP-seq, RNA-seq,CoIP, ChIP, RIP, MeRIP-qPCR等（云序生物提供此服務(wù)）
原文鏈接：m6A mRNA methylation regulates testosterone synthesis through modulating autophagy in Leydig cells

1.自噬對LCs中睪酮的合成至關(guān)重要

本研究中作者檢測了LCs自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B-II，發(fā)現(xiàn)LCs中LC3B-II在細(xì)胞分化過程中表達(dá)增加，并且在成年人LCs中達(dá)到峰值。此外LC3B-II在LCs從莖細(xì)胞向成體細(xì)胞分化過程中表達(dá)量增加，同時血清睪酮水平逐漸升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)沉默ATG7后抑制HsCG誘導(dǎo)LC3B-II表達(dá)和睪酮分泌，表明LCs自噬介導(dǎo)睪酮合成。

圖1. LCs自噬介導(dǎo)睪酮合成

2.LCs的自噬依賴于AMPK信號通路

為了探究LCs自噬過程參與的信號通路，根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)磷酸化AMPK亞基PRKAA2 Thr172是自噬過程中典型的啟動者，并且可以增加其下游蛋白p-ULK1 Ser555的表達(dá)，本次實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)在LCs從莖細(xì)胞向成體細(xì)胞分化的過程中，細(xì)胞中p-RKAA2 Thr172和p-ULK1 Ser555水平穩(wěn)定升高，而且AMPK抑制劑有效抑制HsCG誘導(dǎo)LC3B-II增加，并減少PRKAA2 Thr172和ULK1 Ser555的磷酸化，這些結(jié)果證實(shí)了LCs自噬誘導(dǎo)依賴于AMPK信號通路。

圖2. LCs的自噬依賴于AMPK信號通路

3.CAMKK2/PPM1A參與PRKAA2 Thr172磷酸化過程

為了探究在LCs中HsCG誘導(dǎo)p-PRKAA2 Thr172 增強(qiáng)表達(dá)的機(jī)制，作者檢測了兩種經(jīng)典的磷酸化激酶CAMKK2和STK11/LKB1以及去磷酸化酶PPM1A，數(shù)據(jù)顯示HsCG可以誘導(dǎo)的CAMKK2表達(dá)增加和PPM1A的表達(dá)減少，此外，TM3細(xì)胞和初級LCs在CAMKK2敲低或者過表達(dá)PPM1A后，明顯抑制了HsCG誘導(dǎo)增加LC3B-II的表達(dá)、AMPK活化和降低SQSTM1的表達(dá)。

圖3. CAMKK2/PPM1A參與PRKAA2 Thr172磷酸化過程

4. LCs中的睪酮合成受m6A mRNA修飾調(diào)控

根據(jù)前期研究數(shù)據(jù)顯示m6A修飾可以參與胚胎發(fā)育，那么是否也能夠影響LCs發(fā)育呢？作者利用比色法檢測整體甲基化水平（云序生物提供此服務(wù)），發(fā)現(xiàn)在LCs發(fā)育過程中m6A整體水平逐漸下降，同時ALKBH5（Eraser）和FTO(Eraser)表達(dá)逐漸增加和METTL14(Writer)表達(dá)下調(diào)。為了進(jìn)一步研究m6A修飾在LCs發(fā)育調(diào)控中的重要作用，作者還檢測了無精子癥或少精子癥患者體內(nèi)LCs中m6A的甲基化水平，實(shí)驗表明這些患者體內(nèi)的甲基化水平升高了，并且m6A和HSD3B（睪酮合成能力檢測）呈負(fù)相關(guān)，提示m6A修飾可能介導(dǎo)LCs中睪酮的合成。

圖4. LCs中的睪酮合成受m6A mRNA修飾調(diào)控

5.m6A甲基化影響Camkk2 RNA的穩(wěn)定性

既然m6A能夠影響AMPK信號通路的激活，那么m6A修飾是否作用于Cammkk2呢？作者通過MeRIP-qPCR(云序生物提供此服務(wù))技術(shù)證實(shí)Cammkk2存在2個甲基化修飾位點(diǎn)，同時經(jīng)過HsCG處理后甲基化水平明顯下降，并且利用RIP（云序生物提供此服務(wù)）實(shí)驗分析發(fā)現(xiàn)Cammkk2與YTHDF2(Reader)緊密結(jié)合，這也證實(shí)了m6A修飾降低Camkk2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖5. m6A甲基化影響Camkk2 RNA的穩(wěn)定性

6. m6A甲基化促進(jìn)Ppm1a的翻譯

作者觀察到Y(jié)THDF1（Reader）或METTL14敲除后LCs中PPM1A的表達(dá)降低，但是Ppm1a mRNA的水平?jīng)]有明顯變化，有可能是蛋白穩(wěn)定性或者翻譯效率導(dǎo)致Ppm1a蛋白表達(dá)下降。利用蛋白翻譯抑制劑CHX處理LCs，觀察METTL14敲除與未敲除后PPM1A在LCs中的降解速率，實(shí)驗結(jié)果表明HsCG降低了Ppm1a的表達(dá)，而敲除ALKBH5卻沒有；并且RIP（云序生物提供此服務(wù)）實(shí)驗分析發(fā)現(xiàn)PPM1A與YTHDF1緊密結(jié)合，同時CoIP(云序生物提供此服務(wù))分析表明HsCG處理后促進(jìn)了YTHDF1與EIF3A（真核翻譯起始因子3）和EEF2(真核翻譯起始因子2)結(jié)合,這些結(jié)果都說明m6A只是通過調(diào)節(jié)PPM1A的翻譯而不是影響蛋白的穩(wěn)定性。作者利用MeRIP-qPCR(云序生物提供此服務(wù))進(jìn)一步探討Ppm1a甲基化位點(diǎn)信息，發(fā)現(xiàn)Ppm1a存在5個甲基化修飾位點(diǎn)，并且位于3’U 區(qū)域甲基化位點(diǎn)能夠促進(jìn)Ppm1a的翻譯。

圖6. m6A甲基化促進(jìn)Ppm1a的翻譯

7. HsCG對METTL14/ALKBH5的影響

研究發(fā)現(xiàn)HsCG通過誘導(dǎo)METTL14降解降低其表達(dá)，并且通過提高ALKBH5轉(zhuǎn)錄水平增加ALKBH5的表達(dá)，而CHIP實(shí)驗（云序生物提供此服務(wù)）也證實(shí)HsCG誘導(dǎo)促進(jìn)TFEB和CEBPB與ALKBH5啟動子的結(jié)合從而提高其轉(zhuǎn)錄水平，增加ALKBH5的表達(dá)。

圖7. HsCG對METTL14/ALKBH5的影響

總結(jié)：

 細(xì)胞的生長與分化依賴于基因的調(diào)控表達(dá)方式，越來越多的研究表明m6A 甲基化在更多領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而本文作者正是利用多組學(xué)MeRIP, RIP, CoIP, CHIP（云序生物提供此服務(wù)）等多種技術(shù)聯(lián)合分析，揭示了m6A修飾通過影響Camkk2轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性和Ppm1a的翻譯效率調(diào)節(jié)LCs自噬從而影響睪酮的合成，該研究不僅利用m6A RNA甲基化作為治療血清睪酮水平降低無精子癥或者低精子癥患者的靶點(diǎn)提供了新的治療策略，還為m6A RNA甲基化功能機(jī)制研究提供了新的方向，有望作為治療“不孕不育”的新思路。m6A甲基化始終作為近來科研熱點(diǎn)，相信此次m6A新領(lǐng)域新方向的發(fā)現(xiàn)將會聚焦更多的目光，云序生物一直以來致力于RNA修飾測序服務(wù)，能夠快捷高效助你開拓RNA修飾新“市場”，此時不出手更待何時。更多咨訊請電話熱線直撥，云序RNA甲基化修飾專家給您全方位解答。

圖8. m6A通過睪丸間質(zhì)細(xì)胞的自噬調(diào)節(jié)睪酮的合成

云序生物RNA修飾特色

*云序生物作為國內(nèi)最早做m6A的科研平臺，至今用戶已發(fā)表10多篇m6A相關(guān)文章，其中多篇影響因子超過10分。

*云序生物RNA修飾高通量測序產(chǎn)品覆蓋面廣，包括編碼mRNA和非編碼lncRNA，circRNA，microRNA等分子。云序生物既提供針對單個分子的m6A測序，也提供一次檢測多種RNA分子m6A修飾的全轉(zhuǎn)錄組測序。

*公司長期致力于提供優(yōu)質(zhì)前沿表觀研究測序產(chǎn)品，結(jié)合最新科研熱點(diǎn)繼m6A、m5C、m1A之后，隆重推出多款RNA新修飾，不僅有m7G測序，還包括m3C測序、ac4C乙酰化測序和2'-O-甲基化測序，打造了全修飾和全分子覆蓋的研究平臺。

云序生物國內(nèi)獨(dú)家提供RNA修飾測序一站式服務(wù)

云序生物提供比色法檢測整體m6A修飾水平、RNA修飾測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down機(jī)制等研究服務(wù)。2016年至今，檢測樣本數(shù)量累積超過5000+，MeRIP富集成功率高達(dá)98%以上。為解決客戶樣本量少的問題，云序早已經(jīng)推出超微量MeRIP測序技術(shù)，500ng總RNA即可完成測序。特殊樣本如血清，血漿，外泌體和石蠟等也可進(jìn)行RNA修飾測序。

云序生物m6A RNA甲基化測序技術(shù)服務(wù)流程：

利用m6A特異性抗體，通過免疫共沉淀技術(shù)（MeRIP方法）特異性富集發(fā)生甲基化修飾的RNA，與不處理組（Input）做對比，對m6A修飾進(jìn)行高通量測序和peak峰定位。 

云序優(yōu)勢： 
國內(nèi)10分RNA甲基化文章平臺
率先實(shí)現(xiàn)超微量技術(shù)，低至500ng
全分子覆蓋（circRNA,lncRNA,mRNA等）
全物種覆蓋（動物、植物全覆蓋）

云序生物您身邊的RNA修飾測序?qū)＜遥?/strong>