用細(xì)胞爬進(jìn)行RNA FISH檢測的實驗操作
用細(xì)胞爬片進(jìn)行 RNA FISH 檢測的實驗流程
1. 細(xì)胞在蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞長好后用 CSK 緩沖液簡單洗滌。
2. 細(xì)胞爬片用 4% 多聚甲醛在 4℃ 固定 10 min。
3. 用含有 0.5% TritonX-100,，10 mM VRC 的 CSKBuffer 溶液在 4℃ 處理 10-12 min。
4. 用 70% 酒精，4℃，孵育 10 min。
5. 在-20℃, 分別用 70%，85% 和 100% 的酒精處理 5 min，進(jìn)行脫水，最后風(fēng)干。
然后用中性樹膠將細(xì)胞爬片粘在載玻片上 （正面朝上）。
6. 探針的準(zhǔn)備，將加了探針的雜交緩沖液置于 76℃ 變性處理 10 min。
7. 將 5ul 雜交混合液滴在爬片上，蓋上蓋玻片，經(jīng) Rubber Cement 橡膠封片，置于潮濕暗盒中 37 ℃ 雜交過夜。
8. 雜交后，去除橡膠和蓋玻片，爬片用 50% 甲酰胺 (2XSSC 配) 在 42℃，洗 5 minX3，然后用 2XSSC 在42℃，洗 5 minX3。
9.DAPI 復(fù)染，取適量 DAPI 儲存液用 PBS 稀釋至 1ug/ml 的工作液，吸 5μL 滴爬片上，蓋上蓋玻片，黑暗室溫孵育 5min。去掉蓋玻片，在 PBS 中洗滌 2 次。去掉過量液體，滴加 antifade reagent 封片。
1. 37℃，用合適的含有 FCS，抗生素和其他必要成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。
2. 收集有絲分裂細(xì)胞前 10~16 小時在培養(yǎng)基中以 0.06 μg/ml 的濃度加入秋水仙胺。
收獲細(xì)胞并在聚胺緩沖液中裂解
3. 收獲細(xì)胞。
對于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（500 ml 培養(yǎng)基），室溫 1500 g 離心 5 分鐘收獲細(xì)胞。在室溫用聚胺緩沖液清洗三次所得到的沉淀，1500 g 離心 5 分鐘收集細(xì)胞。
聚胺緩沖液：
15 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)
0.2 mmol/L 精胺
0.5 mmol/L 精咪
2 mmol/L EDTA
80 mmoI/L KCl
0.1 mmol/L PMSF（臨用前從用 100% 乙醇制備的 1 mmol/L 的貯存液中加入）
4. 細(xì)胞用 20 ml 冰冷的含 0.1％ 毛地黃皂苷的聚胺緩沖液重懸浮。
5. 用 Dounce 勻漿器和 B 研棒進(jìn)行 10 次溫和勻漿裂解細(xì)胞（過于劇烈的勻漿會導(dǎo)致染色體明顯損傷）。另外也可以將懸液溫和地吸到一塑料注射器中，然后推動便其通過 25 號針頭（應(yīng)避免溶液起泡沫）。
6. 細(xì)胞裂解后，取出少量裂解液觀察染色質(zhì)釋放情況。在有一滴用來進(jìn)行 DNA 染色的 2 μg/ml Hoechst 33258 的分離緩沖液溶液的載玻片上，滴一滴裂解懸液。用熒光顯微鏡觀察染色質(zhì)。
7. 用 JS-13 ( Beckman)，HB-4 (Sorvall)，2150 (Herace) 或相似的懸桶式轉(zhuǎn)頭在 250 g 離心 1 分鐘沉淀裂解液去除碎片。
8. 取出含有染色體的上清，3000 g 離心 15 分鐘。
9. 將含有染色體的沉淀重懸浮于 5~10 ml 的聚胺緩沖液中。制備的染色體可以在 4℃ 保存。保存 2~4 個星期后觀察不到形態(tài)的變化；但對于特殊目的的研究（例如酶活性，不穩(wěn)定蛋白），得到的染色體應(yīng)立即使用。
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RNA FISH
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