新年伊始，eccDNA（染色體外環(huán)狀DNA）的相關(guān)研究成果不斷。2019年11月同期Nature、Cell報道了環(huán)狀DNA通過高度開放染色質(zhì)、復(fù)雜的拓樸異構(gòu)特征增強表達的顛覆性發(fā)現(xiàn)，2019年12月Nature Genetics也剛剛揭示了eccDNA能夠驅(qū)動神經(jīng)母細胞瘤基因重排的全新功能。這一次，PNAS（美國科學(xué)院院刊）報道了香港中文大學(xué)盧煜明教授團隊的最新研究成果，該成果顯示孕婦血漿中可以鑒定出母親和胎兒的游離環(huán)狀DNA。正如文章中的描述，“優(yōu)于線性DNA的生物穩(wěn)定性以及獨特的分子結(jié)構(gòu)特征讓eccDNA在迅速發(fā)展的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的道路增添了新的方向”�？煲黄饋砜纯催@次有關(guān)eccDNA又有哪些新的發(fā)現(xiàn)吧！

原文鏈接：Identification and characterization of extrachromosomal circular DNA in maternal plasma

發(fā)表期刊：PNAS（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）

影響因子：9.58

發(fā)表日期: 2019.12.03

實驗方法：eccDNA-seq （云序生物可提供此項服務(wù)）

1. 血漿中eccDNA檢測

eccDNA高通量檢測的關(guān)鍵步驟是要通過實驗手段對其進行有效的富集。研究者通過線性DNA的去除、eccDNA的純化、建庫、測序，生物信息分析對反式剪切位點（junction site）的識別從而完成對eccDNA的鑒定。5例孕期女性的血漿樣品中eccDNA的富集與高通量測序結(jié)果顯示：1）核酸外切酶V（exoV）去除線性DNA的過程對eccDNA的富集效果非常明顯；2）同一個體血漿中的eccDNA與線性DNA相比最顯著的特征在于長度分布。線性DNA長度在166bp左右富集，而MspI方法純化的eccDNA主要在202和338bp處有明顯集中，并且338bp處的eccDNA數(shù)目要明顯多于202bp附近的eccDNA個數(shù)。

圖1 線性DNA和eccDNA長度比較

2. 胚胎源和母源eccDNA檢測比較

之前的研究結(jié)果顯示胚胎源（fetal origin）和母源（maternal origin）血漿中線性DNA分子在長度分布不同，通過SNP的方式對eccDNA分子進行來源分類，結(jié)果顯示5例孕期女性個體的eccDNA長度均在約202bp和約338bp兩個地方有明顯富集，但是總體來講累積分布曲線顯示胚胎源eccDNA長度分布總體位于左側(cè)，換言之胚胎源的eccDNA長度要短于母系eccDNA，這種趨勢和兩種來源線性的DNA長度的差異趨勢保持一致。

圖2 eccDNA長度分布和來源多樣性

3. eccDNA的片段化方法優(yōu)化

此項研究當(dāng)中使用的MspI處理方法有一個缺陷，就是MspI總是識別酶切位點的特征序列CCGG，這種識別模式對于長片段eccDNA更有利，因為該分子更有可能含有CCGG序列，利用Tn5隨機剪切的特性能夠有效的解決這一問題，極大的提高eccDNA的檢出。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示胚胎源eccDNA長度主要分布在202bp和338bp附近，相比于母源eccDNA，胚胎源的分子長度相對較短。

圖3 eccDNA MspI和Tn5剪切效果對比

4.母體血漿中eccDNA基因組注釋

母體血漿當(dāng)中的eccDNA分子主要來源于5’UTR區(qū)，外顯子區(qū)以及CpG島，在Alu原件相對較少。這一分布規(guī)律和小鼠組織、非孕期人群血漿當(dāng)中的eccDNA分布保持一致。eccDNA的來源位置并非完全隨機，而是具有一定的偏好性，但母源和胚胎源的eccDNA分布無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。通過比較eccDNA反式剪切位點發(fā)現(xiàn)，少數(shù)剪切位點（322，0.018%）在5例孕期個體當(dāng)中都被檢測到。

圖4 eccDNA的染色體分布

5. eccDNA形成位點的motif探索

eccDNA的反式剪切位點附近是否有motif特征性序列可以闡釋eccDNA的成環(huán)機制？文章中對成環(huán)片段的上游和下游序列進行了進一步討論，剪切位點上下游各50bp左右的位置的motif分析結(jié)果明確了4bp的“空間隔板”，文章中把這種模型描述為“重復(fù)模式（recurrent pattern）”。在S1、S2兩側(cè)分別由四個重復(fù)區(qū)域，1區(qū)和3區(qū)序列相同，2區(qū)和4區(qū)相同，計算機模擬顯示出現(xiàn)這種模式的概率是0.056%，而測序結(jié)果當(dāng)中為3.484%，這種模型非常有利于同源重組和微同源介導(dǎo)的末端剪切，而這一現(xiàn)象也符合經(jīng)典的eccDNA成環(huán)機制。

本篇文章聚焦孕期女性血漿當(dāng)中的eccDNA檢測。不同于線性DNA，eccDNA長度更長，母系來源的eccDNA比胚胎來源的eccDNA分子長度也更長。成環(huán)位點上下游的信息有效的提示了可能的eccDNA形成機制，為接下來eccDNA的進一步研究奠定基礎(chǔ)。這些成果都有利于推動eccDNA在液體活檢以及生物標(biāo)志物方面的應(yīng)用。

2020年年初的寒潮并不能冰凍eccDNA在科研界的火熱。重量級期刊的文章發(fā)表已經(jīng)為我們一年的科研指明了方向，游走在線性DNA之外的eccDNA將是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最閃亮的星。新分子，新方向，機遇與挑戰(zhàn)并存，運氣與實力同在，祝愿各位生物醫(yī)學(xué)的工作者在新的一年能搶占先機，eccDNA將是您科研新年新氣象的不二選擇。

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