新型超微量染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP-seq技術(shù)-Cut&Tag
文章導(dǎo)讀
染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation , ChIP）是研究蛋白質(zhì)與DNA互作的標(biāo)準(zhǔn)方法。通過與高通量測序技術(shù)相結(jié)合，研究者開發(fā)了ChIP-seq技術(shù)，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA片段信息，目前被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳等研究領(lǐng)域。但是ChIP-seq的應(yīng)用存在諸多限制：整個過程十分復(fù)雜，實驗重復(fù)性差，需要甲醛交聯(lián)，并且高度依賴抗體；此外，為了獲得有效富集信號，需要大量細(xì)胞投入，這使得ChIP-Seq在少量細(xì)胞如早期胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞等研究領(lǐng)域力不從心。
新方法、新技術(shù)的革命往往給科學(xué)研究帶來天翻地覆的變化。近期出現(xiàn)的Cut&Tag將繁復(fù)的ChIP-Seq變成便捷簡單的操作，為研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用提供了有效的工具。2019年4月，弗雷德哈欽森癌癥研究中心的Henikoff博士在國際知名學(xué)術(shù)期刊Nature Communications上發(fā)表了Cut&Tag技術(shù)，與傳統(tǒng)ChIP-Seq方法相比，Cut&Tag技術(shù)方法簡便易行，信噪比高，重復(fù)性好，需要的細(xì)胞數(shù)量少至60個，且有望將ChIP-Seq做到單細(xì)胞水平，開創(chuàng)了ChIP-seq新革命。小編帶領(lǐng)大家一起來領(lǐng)略這項前沿技術(shù)的風(fēng)采。
原文鏈接：Cut&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：11.878
發(fā)表日期：20190429
1.Cut&Tag原理
ChiTag是Protein A蛋白與Tn5轉(zhuǎn)座酶的融合蛋白，當(dāng)抗體結(jié)合目的蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白等）后，Protein A蛋白可直接結(jié)合抗體，攜帶的Tn5轉(zhuǎn)座酶可特異性的切割目的蛋白附近的DNA片段，并將DNA片段連上接頭，文庫構(gòu)建后進(jìn)行高通量測序。
圖1 Cut&Tag實驗流程圖
2. Cut&Tag優(yōu)勢
為證明Cut&Tag技術(shù)的有效性，作者在對組蛋白H3K27me3進(jìn)行研究時對比使用了ChIP-seq、Cut&RUN、Cut&Tag三種方法。從不同角度對三組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)Cut&Tag技術(shù)具有顯著優(yōu)勢，具體結(jié)果如下：
（1）背景噪音低
為了直接比較這三種技術(shù)，作者將三種方法的數(shù)據(jù)量都設(shè)置為8M Reads，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種方法得出的峰圖相似，但是ChIP-seq的背景噪聲非常高，增加數(shù)據(jù)量到50M Reads時，才能達(dá)到類似的峰圖，因此ChIP-seq需要更大的測序深度才能將染色質(zhì)特征與背景區(qū)分開。相反，Cut＆RUN和Cut＆Tag均具有極低的背景噪聲水平，其中Cut＆Tag的背景噪音最低。
圖2 三種方法背景噪音比較
（2）信號值高，靈敏度好
為了量化三種方法的敏感性，作者分別檢測了三種方法不同測序深度下峰的富集效率圖，發(fā)現(xiàn)Cut＆Tag可以更快地填充低測序深度的峰，其中約2M Reads相當(dāng)于Cut＆RUN的8M Reads或ChIP-seq的20M Reads，結(jié)果表明相同測序深度下，Cut＆Tag檢測的信號值更高。同時，作者又分析了相同測序深度下（8M Reads），峰圖形成的靈敏度，由于ChIP-seq的靈敏度相對較低，所以作者增加了一個40M Reads數(shù)據(jù)量下的峰圖，比較后發(fā)現(xiàn)仍舊是Cut＆Tag峰圖最顯著，且比ChIP-seq的40M Reads峰圖都高，表明Cut＆Tag的靈敏度最高。
圖3 三種方法信號強(qiáng)度比較
（3）重復(fù)性好
為了檢測三種方法的可重復(fù)性，作者分別對三種方法做了兩次重復(fù)實驗，并對實驗結(jié)果進(jìn)行分層聚類相關(guān)矩陣分析，證明了Cut＆Tag實驗可重復(fù)性最好。
圖4 三種方法重復(fù)性相關(guān)矩陣
總結(jié)
Cut&Tag是蛋白質(zhì)-DNA互作關(guān)系研究的新方法，相較于傳統(tǒng)的ChIP-Seq具有以下優(yōu)點：所需細(xì)胞量少，背景信號低，可重復(fù)性好，無需ChIP級別抗體等優(yōu)點，甚至可用于單細(xì)胞水平測序。Cut&Tag技術(shù)可從基因組范圍內(nèi)檢測組蛋白、RNA polymerase II和轉(zhuǎn)錄因子等蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)端，應(yīng)用于臨床和科研的表觀遺傳學(xué)研究，或是結(jié)合生物信息學(xué)分析，找到轉(zhuǎn)錄因子下游調(diào)控的靶基因，為進(jìn)一步闡明生物學(xué)機(jī)制提供依據(jù)。
云序生物Cut&Tag技術(shù)服務(wù)：
Cut&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是蛋白質(zhì)-DNA互作關(guān)系研究的新方法，是新一代超微量ChIP-Seq技術(shù)，適用于無ChIP級別抗體的蛋白研究。與傳統(tǒng)的ChIP-Seq研究方法相比，該技術(shù)無需交聯(lián)、超聲打斷、末端抹平和接頭連接等操作，因此具有省時高效、所需樣品量少、背景信號低和可重復(fù)性好等優(yōu)點，甚至可用于單細(xì)胞水平測序。Cut&Tag有望將蛋白質(zhì)-DNA互作的研究變成一種類似PCR反應(yīng)的常規(guī)操作，對基因調(diào)控、表觀遺傳等領(lǐng)域的研究具有革命性的意義。
產(chǎn)品優(yōu)勢
-
樣品起始量低：能夠?qū)吧倭繕悠愤M(jìn)行分析
-
無需ChIP級別抗體：無需提供ChIP級別抗體
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性價比高：背景噪音低，所需測序深度少
-
實驗重復(fù)性好：實驗重復(fù)結(jié)果一致性好
實驗流程
云序生物Cut&Tag實驗流程圖
樣本要求
1）樣品類型：細(xì)胞、組織，其它樣品信息請詳詢
2）樣品量
細(xì)胞：5×105
組織：5mg
3）樣品保存：細(xì)胞樣品或新鮮組織塊，液氮凍存后，-80℃ 保存。
4）樣品運(yùn)輸：干冰運(yùn)輸。
云序生物分子互作技術(shù)：
云序作為一家依托于高通量測序的科研服務(wù)公司，除了提供優(yōu)質(zhì)測序服務(wù)，還為客戶提供機(jī)制研究的服務(wù)，助力用戶發(fā)表高分文章，其中包括研究蛋白互作的CoIP技術(shù)、RNA與蛋白/RNA互作的RNA pull-down技術(shù)、蛋白與DNA互作的ChIP和ATAC技術(shù)，近期更推出了新一代ChIP-seq技術(shù)Cut&Tag，囊括了DNA、RNA和蛋白質(zhì)這三類經(jīng)典大分子互作研究的重要技術(shù)。
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云序生物往期回顧
Cebola Inês,Pancreatic Islet Transcriptional Enhancers and Diabetes.[J] .Curr. Diab. Rep., 2019, 19: 145.
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