lncRNA MIR100HG和miR100以及miR125b在CRC抗cetuximab的調控作用
lncRNA MIR100HG-derived miR-100 and miR-125b mediate cetuximab resistance via Wnt/β-catenin signaling
來源于lncRNA MIR100HG的miR-100和miR-125b通過Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路調控結直腸癌的抗西妥昔單抗效果
結直腸癌（colorectal cancer ,CRC）無論是在發(fā)病率還是在死亡率中都是最高的三類癌癥之一[1]，早期結直腸患者沒有癥狀，所以需要通過腸鏡和基因篩查的方法去診斷。西妥昔單抗（cetuximab）和帕尼單抗是表皮生長因子受體（EGFR）單克隆抗體，能夠結合細胞外EGFR區(qū)域增強受體的內吞和降解，一般可與化療藥物聯(lián)用治療CRC�；颊邔etuximab治療的耐藥和KRAS、NRAS、BRAF、EGFR的基因突變可能有關，文章通過研究lncRNA MIR100HG和其包含的2個miRNA，miR-100和miR-125b,對CRC和頭部頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞系對cetuximab耐藥機制的研究，發(fā)現(xiàn)miR-100和miR-125b都能下調5個負調控Wnt-β-catenin信號的分子，來促進Wnt信號通路，從而促進癌細胞的耐cetuximab性能。同時發(fā)現(xiàn)MIR100HG的表達能促進miR-125b的表達，miR-125b的表達能抑制GATA6的表達，而GATA6的表達又能抑制HIR100HG的表達，而MIR100HG的高表達與CRC病人的耐cetuxima過程有關。該研究為治療和診斷結直腸癌的耐cetuxima提供一定的參考意義。
補充：約有17.5%的miRNA來源于lncRNA,定義為lnc-pri-miRNA，對這種miRNA的轉錄形成機制感興趣的童鞋可以看這篇文獻(Microprocessor mediates transcriptional termination in genes encoding long noncoding microRNAs)
來源于lncRNA MIR100HG的miR-100和miR-125b通過Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路調控結直腸癌的抗西妥昔單抗效果
結直腸癌（colorectal cancer ,CRC）無論是在發(fā)病率還是在死亡率中都是最高的三類癌癥之一[1]，早期結直腸患者沒有癥狀，所以需要通過腸鏡和基因篩查的方法去診斷。西妥昔單抗（cetuximab）和帕尼單抗是表皮生長因子受體（EGFR）單克隆抗體，能夠結合細胞外EGFR區(qū)域增強受體的內吞和降解，一般可與化療藥物聯(lián)用治療CRC�；颊邔etuximab治療的耐藥和KRAS、NRAS、BRAF、EGFR的基因突變可能有關，文章通過研究lncRNA MIR100HG和其包含的2個miRNA，miR-100和miR-125b,對CRC和頭部頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞系對cetuximab耐藥機制的研究，發(fā)現(xiàn)miR-100和miR-125b都能下調5個負調控Wnt-β-catenin信號的分子，來促進Wnt信號通路，從而促進癌細胞的耐cetuximab性能。同時發(fā)現(xiàn)MIR100HG的表達能促進miR-125b的表達，miR-125b的表達能抑制GATA6的表達，而GATA6的表達又能抑制HIR100HG的表達，而MIR100HG的高表達與CRC病人的耐cetuxima過程有關。該研究為治療和診斷結直腸癌的耐cetuxima提供一定的參考意義。
補充：約有17.5%的miRNA來源于lncRNA,定義為lnc-pri-miRNA，對這種miRNA的轉錄形成機制感興趣的童鞋可以看這篇文獻(Microprocessor mediates transcriptional termination in genes encoding long noncoding microRNAs)
這篇文章的主要研究結果如下
1. 建立了抗cetuximab的腫瘤細胞
1）作者團隊選用KRAS/NRAS/BRAF基因未突變的微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結直腸癌細胞，HCA-7，同時采用3維細胞培養(yǎng)技術來建立抗cetuximab（CTX）的結直腸癌細胞團（CC-CR）。一個簡單抗CTX細胞系的構建就需要4個月，經歷不少于20次2維細胞培養(yǎng)和3維加藥細胞培養(yǎng)的循環(huán)，科研果然是寂寞的重復！
2）成功構建CC-CR后作者又通過一系類的驗證來確定CC-CR的確是抗CTX。首先通過DIC（微分干涉對比顯微鏡）對比CC（對cetuximab敏感的結直腸癌細胞團）和CC-CR的形態(tài)差異，發(fā)現(xiàn)CC是中空的排列整齊的單細胞團，而CC-CR是實質紊亂的細胞團。其次是用CTX處理CC和CC-CR觀察其克隆存活數(shù)和增殖、凋亡情況，發(fā)現(xiàn)CC在CTX的存在情況下克隆數(shù)大幅度下降、增殖抑制、凋亡細胞明顯增多，而CC-CR基本沒有差異。最后在動物實驗上檢測了CC異種移植瘤對CTX敏感，而CC-CR異種移植瘤無懼CTX依然保持著低分化和增殖特性。做科研就要從保持嚴謹?shù)膽B(tài)度，多方面驗證自己的結論，這樣才會避免被撤稿危機。
1. 建立了抗cetuximab的腫瘤細胞
1）作者團隊選用KRAS/NRAS/BRAF基因未突變的微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結直腸癌細胞，HCA-7，同時采用3維細胞培養(yǎng)技術來建立抗cetuximab（CTX）的結直腸癌細胞團（CC-CR）。一個簡單抗CTX細胞系的構建就需要4個月，經歷不少于20次2維細胞培養(yǎng)和3維加藥細胞培養(yǎng)的循環(huán)，科研果然是寂寞的重復！
2）成功構建CC-CR后作者又通過一系類的驗證來確定CC-CR的確是抗CTX。首先通過DIC（微分干涉對比顯微鏡）對比CC（對cetuximab敏感的結直腸癌細胞團）和CC-CR的形態(tài)差異，發(fā)現(xiàn)CC是中空的排列整齊的單細胞團，而CC-CR是實質紊亂的細胞團。其次是用CTX處理CC和CC-CR觀察其克隆存活數(shù)和增殖、凋亡情況，發(fā)現(xiàn)CC在CTX的存在情況下克隆數(shù)大幅度下降、增殖抑制、凋亡細胞明顯增多，而CC-CR基本沒有差異。最后在動物實驗上檢測了CC異種移植瘤對CTX敏感，而CC-CR異種移植瘤無懼CTX依然保持著低分化和增殖特性。做科研就要從保持嚴謹?shù)膽B(tài)度，多方面驗證自己的結論，這樣才會避免被撤稿危機。
2. 發(fā)現(xiàn)在抗cetuximab細胞中MIR100HG和來源于這個lncRNA的兩個miR-100、miR-15b的表達上調
1） 作者是怎樣發(fā)現(xiàn)長非編碼RNA-MIR100HG和miR-100、miR-125b在抗cetuximab 結直腸癌細胞中高表達的呢？當然是我們永諾生物擅長做的基因測序！作者將3維培養(yǎng)的CC和CC-CR進行全外顯子測序和RNA-Seq，沒有發(fā)現(xiàn)與已知的抗cetuximab相關的基因，但是RNA-Seq發(fā)現(xiàn)大量差異表達的轉錄本。利用miRNA-Seq發(fā)現(xiàn)7個上調的miRNA和24個下調的miRNA。而且差異表達的轉錄本中l(wèi)ncRNA MIR100HG是上調最顯著的，而差異表達的miRNA中上調最顯著的是miR100和miR-125b。
2） 通過QPCR驗證了MIR100HG和miR-100、miR-125b在CC-CR中高表達，同時利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析了MIT100HG的表達和miR-100、miR-125b的相關性，發(fā)現(xiàn)他們的確是有緊密聯(lián)系。作者還利用FISH發(fā)現(xiàn)與CC異種異種移植瘤相比MIR100HG和miR-100、miR-125b在CC-CR異種移植瘤中富集。并分析其他30種CRC細胞系中MIR100HG和miR-100、miR-125b的表達情況，發(fā)現(xiàn)在抗cetuximab CRC細胞系中MIR100HG和miR-100、miR-125b的表達更高。
3） 作者還在8種頭部頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞系中檢測了MIR100HG和miR-100、miR-125b的表達，發(fā)現(xiàn)抗cetuximab的NHSCC細胞系中MIR100HG和miR-100、miR-125b的表達上調。
3. MiR-100和miR-125b協(xié)同促進細胞的抗cetuximab
作者通過構建miR-100和miR-125b的過表達和干擾（sponge）慢病毒，構建穩(wěn)定表達miR-100、miR-125b以及其sponge的CC、CC-CR細胞系。發(fā)現(xiàn)過表達CC或是干擾CC-CR的miR-100對的細胞的抗cetuximab能力沒有miR-125b強。作者從3個方面進行了驗證：1）CTX處理miRNA改變后CC和CC-CR檢測其克隆的形成，2）檢測增殖和凋亡，3）在裸鼠皮下種植異種瘤檢測腫瘤大小。3個實驗顯示CC過表達miRNA后其抗cetuximab能力上升，而CC-CR過表達miRNA的sponge后其抗cetuximab的能力下降。作者同時還在其他結直腸癌細胞系和HNSCC細胞系中驗證了miR-100和miR-125b協(xié)同促進細胞的抗cetuximab作用。
4. MiR-100和miR-125b通過抑制多個Wnt負調控因子增加Wnt信號
1） 作者通過分析上面mRNA測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在CC-CR里下調的基因有Wnt信號通路下調分子（DDK1和DDK3），而Wnt的活性在CC-CR里是激活的。作者猜想miR-100和miR-125b可能通過Wnt的下調分子來激活Wnt信號。利用生物信息學分析軟件和網站作者發(fā)現(xiàn)DDK1的3’UTRs區(qū)有miR-100的結合位點，而DDK3的3’UTRs區(qū)有miR-125b的結合為點。作者還分析了Wnt的其他負調控分子ZNRF3、RNF43、APC2有miR-100和miR-125b的結合位點。然后通過構建這5個負調控分子的雙熒光報告質粒，通過雙熒光分析實驗確認他們的確有相互作用位點。WB檢測了CC過表達miRNA后這5個分子的表達下降和CC-CR干擾miRNA后這5個負調控分子的表達升高。
2） 隨著Wnt負調控分子的表達降低，Wnt分子激活，在CC-CR中酪氨酸磷酸化的p-Y489β-catenin激活增加而且增加了核β-catenin，同時Wnt靶基因（CCND1、KLF4、MYC、NKD1、PROX1、S100A4）mRNA水平上升。CC過表達miRNA時Wnt的靶基因mRNA水平也隨著上升，在其他結直腸癌細胞同樣有這樣的現(xiàn)象。
1） 作者通過分析上面mRNA測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在CC-CR里下調的基因有Wnt信號通路下調分子（DDK1和DDK3），而Wnt的活性在CC-CR里是激活的。作者猜想miR-100和miR-125b可能通過Wnt的下調分子來激活Wnt信號。利用生物信息學分析軟件和網站作者發(fā)現(xiàn)DDK1的3’UTRs區(qū)有miR-100的結合位點，而DDK3的3’UTRs區(qū)有miR-125b的結合為點。作者還分析了Wnt的其他負調控分子ZNRF3、RNF43、APC2有miR-100和miR-125b的結合位點。然后通過構建這5個負調控分子的雙熒光報告質粒，通過雙熒光分析實驗確認他們的確有相互作用位點。WB檢測了CC過表達miRNA后這5個分子的表達下降和CC-CR干擾miRNA后這5個負調控分子的表達升高。
2） 隨著Wnt負調控分子的表達降低，Wnt分子激活，在CC-CR中酪氨酸磷酸化的p-Y489β-catenin激活增加而且增加了核β-catenin，同時Wnt靶基因（CCND1、KLF4、MYC、NKD1、PROX1、S100A4）mRNA水平上升。CC過表達miRNA時Wnt的靶基因mRNA水平也隨著上升，在其他結直腸癌細胞同樣有這樣的現(xiàn)象。
3） 用Wnt的負調控分子DDK1和DDK3的重組蛋白能恢復部分CC-CR的cetuximab的敏感性，使CC-CR的增殖降低、凋亡增加。同時利用Wnt的抑制劑XAV-939和ICG-001也能恢復CC-CR的cetuximab的敏感性，聯(lián)合使用cetuximab和ICG-001能抑制CC-CR異種移植瘤的生長。
綜上述，阻斷Wnt信號，無論是APC/β-catenin上游還是下游，降解復合物能恢復抗cetuximab細胞的cetuximab的敏感性。
5. MIR100HG/miR-125b與GATA6是負調控關系
1）作者通過Match program軟件分析MIR100HG的轉錄啟動子2.5Kb區(qū)域能結合的轉錄因子，和RNA-seq結果進行比對，發(fā)現(xiàn)了轉錄因子GATA6既能結合MIR100HG的啟動子區(qū)域又在CC-CR里表達下調。CC用cetuximab刺激后GATA6的表達下降，但是用cetuximab處理48h后GATA6的mRNA水平顯著上升；CC里的GATA6敲除后MIR100HG表達上調，而且不再受cetuximab的調控，說明GATA6能有負調控MIR100HG。通過雙熒光報告實驗發(fā)現(xiàn)MIR100HG啟動子活性受GATA6抑制，且程劑量依賴。
2） 作者進一步分析了GATA6與MIR100HG啟動子結合的區(qū)域，在MIR100HG啟動子區(qū)域預測了4個GATA結合位點，通過逐步截斷和突變發(fā)現(xiàn)了GATA-binding site 2是GATA6抑制MIR100HG轉錄活性的主要位點。并通過CHIP和EMSA實驗來證明GATA6和MIR100HG的GATA-binding site 2有結合。
3）通過分析發(fā)現(xiàn)GATA6的3’UTR區(qū)域有miR-125b的結合位點，通過雙熒光報告系統(tǒng)檢測到GATA6的確與miR-125b有結合。在CC里過表達miR-125b時GATA6的表達下降；而在CC-CR里干擾miR-125b時GATA6的表達上調。作者還在利用TCGA數(shù)據(jù)分析了CRC中GATA6和MIR100HG的相關性，發(fā)現(xiàn)在IV期CRC病人中GATA6是的低表達而MIR100HG是高表達。
總之，MIR100HG的轉錄受轉錄因子GATA6的抑制，但是miR-125b的高表達能抑制GATA6的表達，而MIT100HG高表達會促進miR-125b的表達，這三者之間形成了一個雙反饋調節(jié)CC細胞的抗體cetuximab。
6. MIR100HG、miR100和miR125b在發(fā)展為抗cetuximab的結直腸癌中表達上調
作者最后利用臨床數(shù)據(jù)分析了CRC病人在用cetuximab過程中miR-100、miR-125b等研究分子的改變，發(fā)現(xiàn)在cetuximab治療后miR-100、miR-125b和核β-catenin的表達上調。GATA6與前期研究結果相反，在cetuximab治療后同樣是表達升高，且無論是miR-125b與GATA6還是miR-100與GATA6都沒有負相關性。利用FISH檢測CRC組織里miR-100、miR-125b、MIR100HG、β-catenin、GATA6的表達，發(fā)現(xiàn)與前期研究一致，都是在cetuximab治療后miR-100、miR-125b、MIR100HG、β-catenin的表達上升，而GATA6的表達下降。
6. MIR100HG、miR100和miR125b在發(fā)展為抗cetuximab的結直腸癌中表達上調
作者最后利用臨床數(shù)據(jù)分析了CRC病人在用cetuximab過程中miR-100、miR-125b等研究分子的改變，發(fā)現(xiàn)在cetuximab治療后miR-100、miR-125b和核β-catenin的表達上調。GATA6與前期研究結果相反，在cetuximab治療后同樣是表達升高，且無論是miR-125b與GATA6還是miR-100與GATA6都沒有負相關性。利用FISH檢測CRC組織里miR-100、miR-125b、MIR100HG、β-catenin、GATA6的表達，發(fā)現(xiàn)與前期研究一致，都是在cetuximab治療后miR-100、miR-125b、MIR100HG、β-catenin的表達上升，而GATA6的表達下降。
作者沒有詳細解釋為什么出現(xiàn)GATA6與miR-125b的關系在統(tǒng)計10例CRC病人經過cetuximab治療后表達沒有成負相關結果。但是作者誠實的將這個結果呈現(xiàn)在文獻里，說明出現(xiàn)相反的結果可以不用懷疑自己的結果，可能那就是真實的結果，要學會接受。
最后用一張作者補充數(shù)據(jù)的圖來解釋全部研究分子之間的關系：作者發(fā)現(xiàn)了非編碼RNA MIR100HG以及其編碼的2個miRNA參與調控Wnt信號通路激活引起的抗cetuximab效應。
