基因人源化動物模型應用與構建
人源化動物模型（Humanized Animal Model ）
指攜帶有人源的功能性基因、細胞、組織或者器官的動物模型，是目前常用的最接近人類的疾病研究動物模型。前幾期我們已經介紹了人源細胞及組織的移植模型，本期著重介紹基因人源化的動物模型。
基因人源化動物模型 利用轉基因或同源重組的方法，將人源基因放在動物基因組內，在動物體內表達人源的基因，動物自身基因不再表達。
為什么進行基因人源化呢？
小鼠與人類基因組雖具有高度同源性，但是很少有功能性基因在人鼠上具有100%的保守性，這種差異很可能會導致動物和人體結果的出入。如以下例子可以說明：
舉例1：如在藥物代謝中，利福平不能誘導小鼠肝臟中的CYP3A的表達，而將小鼠的PXR基因人源化之后，利福平表現出對小鼠肝臟CYP3A的強誘導作用�？梢娔Ｐ蛣游锏娜嗽椿茉谝欢ǔ潭壬希朔虿町愒斐傻姆N屬差異（下圖）[1]。
PXR的人源化能顯著增強利福平（RIF）對小鼠肝臟CYP3A的誘導作用
舉例2：又如在腫瘤免疫治療中，小鼠的免疫檢查點基因與人類對比，在蛋白氨基酸序列上相似性僅約60%。因此若選擇小鼠來檢測抗人蛋白抗體的藥效，抗體很可能不識別小鼠相應蛋白。這就需要將小鼠的免疫檢查點基因進行人源化改造，因此hPD-1小鼠應運而生。
舉例3：如在病毒感染中，表達野生型CD81和OCLN（occludin）的小鼠對HCV（HepatitisC Virus）不敏感，而在小鼠體內表達這兩個基因的人源同源基因之后，小鼠便會受到HCV的感染[2]。
人源化動物模型應用
基因人源化動物模型大大提高了模擬人類某些疾病的有效性，目前應用很廣泛，如下：
①人類基因的功能研究，解碼人類疾病奧秘；
②腫瘤免疫治療研究，如h-PD-1小鼠；
③臨床前藥物評價：藥效，藥物代謝研究等；
④ 疾病研究：癌癥、傳染病、血液病研究等；
⑤組織或者器官供體動物的制備等。
下面看看，基因人源化模型是如何構建的呢？
基本原理：運用DNA定點同源重組的原理，將人源的基因的部分片段（如重要結構域、編碼區(qū)等）或者基因全長（如所有外顯子和內含子、啟動子區(qū)域、3’和5’-UTR等）定點整合到實驗動物特定的基因位點，進而達到替換掉實驗動物的該基因的目的。如下圖所示：
人源化動物模型構建示意圖
目前應用較多的是利用ES細胞同源重組技術和CRISPR/Cas9顯微共注射技術構建基因人源化動物模型。但由于ES細胞培養(yǎng)和操作的物種限制和得到純合人源化動物的周期也相對較長，因此該方法具有一定局限性。
CRISPR/Cas9是利用顯微共注射直接將CRISPR/Cas9系統和同源重組質粒注射進動物的受精卵，不需要培養(yǎng)和操作ES細胞，得到純合人源化動物的周期也相對較短，但缺少了體外篩選的過程，獲得陽性子代的概率就相對較小。
構建注意事項
基因人源化的本質即基因大片段敲入，構建過程在之前的KI文章描述過，不再贅述。需要注意的是：構建基因人源化動物模型的關鍵在于提高人源基因同源重組效率，目前有以下幾個方向：
①優(yōu)化同源重組載體同源臂的長度；
②在Cas9上融合表達能提高同源重組的蛋白；
③抑制非同源重組末端連接的發(fā)生；
④ES細胞的體外篩選，可以提高陽性子代的獲得率，所以開發(fā)更多物種的ES細胞的培養(yǎng)和操作方法也能間接提高同源重組的成功率。
下面以2個較常用的模型為例，為大家詳細講解：
一、人源化藥物代謝動物模型藥物的吸收、分布、代謝以及消除（ADME）影響著藥物在人體內的有效性和安全性，其中人體的幾類蛋白扮演著重要角色，然而它們卻在人鼠之間卻存在很大差異。
①如幾個主要參與藥物代謝的CYP450酶，其人鼠之間基因序列的相似性大都75%左右，其中最重要CYP3A，人鼠間序列的相似性不足70%[3]；
②且人鼠間CYP450酶的亞型分布也有較大差異；人CYP2C的亞型僅有CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19四個亞型，但大鼠和小鼠中分別有七個和九個CYP2C亞型[3]；
③對于異型生物質受體，不同物種間的同源受體可能對同一物質具有不同的敏感性。如上文提到的人源的PXR對RIF敏感，而鼠源的PXR對PCN敏感[1]。
因此，普通小鼠上進行的藥物評價是僅僅不夠的，將這些關鍵基因在動物上進行人源化，建立基因結構、表達譜和調節(jié)方式與人類相似的模型，才是解決種屬差異的有效途徑之一。
目前國際上已有一些人類藥物相關基因人源化小鼠，比如CYP3A4人源化小鼠，PXR-CAR雙基因人源化小鼠，AHR人源化小鼠等。近幾年來，由于CRISPR/Cas9基因組編輯技術的成熟，使大鼠的人源化成為可能。
我國已經建立了一些藥物代謝基因的大鼠模型，如Abcb1、AHR人源化大鼠模型。
下面以Cyp3a4/Cyp3a7/PXR/CAR多基因人源化小鼠模型構建為例：
CYP3A4（Cytochrome P450 3A4）是人肝腸中主要表達的一個Ⅰ相藥物代謝酶，參與了約50%的臨床藥物的代謝。但人和小鼠之間的Cyp3a基因具有較大種屬差異，使得候選化合物在小鼠的代謝情況與人的代謝情況存在一定差異。
另外，PXR（Pregnane X Receptor）和CAR（Constitutive Androstane Receptor）是Cyp450上游的調節(jié)基因，能參與到Cyp3a4等亞型的誘導表達。PXR、CAR具有的人鼠差異也會影響小鼠模型對化合物的代謝研究結果在人上的可適用性。
如下圖為：Cyp3a4/Cyp3a7/PXR/CAR多基因人源化模型的構建過程
Cyp3a4/Cyp3a7/PXR/CAR人源化小鼠模型構建 [4]
具體可簡述為如下步驟 [4]：
1、為敲除小鼠Cyp3a57-Cyp3a25基因簇，分別構建包含篩選標記和loxP等位點的靶向小鼠Cyp3a57和Cyp3a59的打靶載體（如上圖A-C所示）；
2、將1中打靶載體轉入小鼠ES細胞，針對Cyp3a57-Cyp3a25基因簇的5’和3’端，通過同源重組引入兩個同向loxP位點（如上圖D所示）；
3、通過在小鼠ES細胞中轉染Cre質粒實現由Cre-loxP介導的Cyp3a57-Cyp3a25基因簇的缺失（如上圖E所示）；
4、構建含loxP位點和人源Cyp3a4/Cyp3a7基因片段的打靶載體（如上圖F所示）；
5、將4中打靶載體轉入3中ES細胞，通過Cre-loxP介導的不同DNA鏈間的染色體易位實現人源Cyp3a4/Cyp3a7基因的定點整合（如上圖G、H所示）；
6、體外編輯好的ES細胞經囊胚注射、嵌合鼠繁殖，背景純化，最終獲得純合子Cyp3a4/Cyp3a7人源化小鼠;
7、將Cyp3a4/Cyp3a7人源化小鼠和PXR、CAR人源化小鼠進行雜交，即可獲得Cyp3a4/Cyp3a7/PXR/CAR人源化小鼠。
構建時需要注意的事項
對于多基因人源化，若兩個基因不在同一條染色體上，一般先分別進行打靶，然后再將單個基因人源化小鼠進行交配，得到多基因人源化小鼠。在這個過程中，一定要驗證每一個單基因人源化小鼠是正確而有功能的。由于Cyp450基因亞型眾多，這給Cyp450全基因敲除和人源化帶來了一定難度。
數據分析：如下圖所示，研究人員通過構建Cyp3a4/Cyp3a7/PXR/CAR多基因人源化小鼠模型，觀察到了RIF，磺吡酮（SUL）以及吡格列酮（PIO）成功通過人源PXR誘導人源CYP3A4的表達，在一定程度上克服了種屬差異[4]。
Cyp3a4/ Cyp3a7/PXR/CAR人源化小鼠對藥物具有和人相似的敏感性[4]
腫瘤免疫療法是當前腫瘤治療領域中最具前景的研究方向之一，特別是T細胞免疫檢查點抗體成為了腫瘤治療的有力主角，包括PD-1、PD-L1和CTLA4等。
PD-1，即程序性死亡受體1，是一種重要的免疫抑制分子，PD-1抑制劑是目前非�；钴S的一個腫瘤免疫治療藥物。如下為PD-1抑制劑作用原理：
PD-1抑制劑作用原理圖（圖片來自網絡）
但是，該療法要求實驗動物須具備正常的免疫系統，同時，表達人類免疫檢查點分子。因此需要對動物的PD-1進行人源化，即將小鼠的PD-1基因換成人的對應部分，才可更為精準地評價PD-1抗體藥物在人體內的作用。
PD-1人源化小鼠的構建過程可簡述為如下步驟 [5]：
1、構建包含人源PD-1基因胞外蛋白對應序列（包括第二個外顯子的全部序列和第三個外顯子的部分序列）的打靶載體；
2、將打靶載體轉入小鼠ES細胞，經篩選標記篩選出正確整合的ES細胞；
3、將整合正確的ES細胞注射進八細胞期小鼠胚胎，得到嵌合體子代；
4、嵌合體子代與C57BL/6N進行雜交，經背景純化最終得到純合的PD-1人源化小鼠模型。
如下圖所示：人源化PD-1小鼠可用于PD1抑制劑的評價：
PD-1抗體REGN2810能顯著性增加人源化小鼠的生存率[5]
生命醫(yī)學的研究離不開動物實驗，然而實驗動物和人之間的種屬差異是客觀存在的。因此，人源化動物的研究必定是生命醫(yī)學研究中十分重要的一環(huán)。
目前，在這個領域還存在許多需要攻克的困難和需要思考的問題，比如人源化動物模型構建技術的改良及新技術的發(fā)明，模型構建成本的控制，以及隨著人源化動物越來越“像人”所帶來的一系列倫理問題等。
當然，動物實驗中最基本的一個倫理問題就是動物福利，實驗動物是人類的受難者，是人類實驗的替代品，在進行動物實驗時請務必善待你的實驗動物。
致謝：感謝陳曦同學在基因編輯技術理論方面提供的幫助！
參考資料：
[1] Ma, X. et al. The PREgnane X receptor gene-humanized mouse: a model for investigating drug-drug interactions mediated by cytochromes P450 3A. Drug Metab. Dispos. 35, 194-200, doi:10.1124/dmd.106.012831 (2007).
[2] Ding, Q. et al. Mice Expressing Minimally Humanized CD81 and Occludin Genes Support Hepatitis C Virus Uptake In Vivo. J. Virol. 91, doi:10.1128/JVI.01799-16 (2017).
[3] Martignoni, M., Groothuis, G. M. & de Kanter, R. Species differences between mouse, rat, dog, monkey and human CYP-mediated drug metabolism, inhibition and induction. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 2, 875-894, doi:10.1517/17425255.2.6.875 (2006).
[4] Hasegawa, M. et al. Quantitative prediction of human pregnane X receptor and cytochrome P450 3A4 mediated drug-drug interaction in a novel multiple humanized mouse line. Mol. Pharmacol. 80, 518-528, doi:10.1124/mol.111.071845 (2011).
[5] Burova, E. et al. Characterization of the Anti-PD-1 Antibody REGN2810 and Its Antitumor Activity in Human PD-1 Knock-In Mice. Mol. Cancer Ther. 16, 861-870, doi:10.1158/1535-7163.MCT-16-0665 (2017).
