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基因編輯鼠 sgRNA表達載體構(gòu)建

瀏覽次數(shù):7243 發(fā)布日期:2019-8-2 
繼上次發(fā)表的Guide RNA設(shè)計和篩選的相關(guān)知識之后,希望大家還沒有忘記相關(guān)的操作和技巧,今天,我們就來和大家聊聊后續(xù)的實驗,在基因編輯鼠的過程中,sgRNA表達載體是如何構(gòu)建的呢?

在靶點篩選結(jié)束之后,下一步就要進行sgRNA載體構(gòu)建。在構(gòu)建表達載體前,應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康倪x取合適的表達質(zhì)粒。比如進行實驗時考慮是否需要reporter標簽,是否需要藥物篩選基因等。

接下來以構(gòu)建px330質(zhì)粒為例,具體說明如何構(gòu)建sgRNA表達載體。(圖1)

  1. 先確定20bp靶標序列(基因組序列應(yīng)為20bp+NGG);

  2. 如20bp第一個為G,則略過此部分;在20bp前額外添加一個G,形成G+20bp序列(U6 human promoter轉(zhuǎn)錄時需要起始堿基為G);

  3. 在20bp或G+20bp 5’前添加caccg,形成cacc-G+20bp序列,則為Forward序列(直接合成即可);

  4. 將20bp或G+20bp 進行反向互補,并在5’前添加aaac,則為Reverse序列(直接合成即可);

  5. 合成的sgRNA正反向堿基(摩爾濃度為100μM)進行退火,使之堿基配對并形成雙鏈結(jié)構(gòu);

  6. BbsI酶切px330質(zhì)粒,并對酶切后的載體進行回收;

  7. 將退火配對后的sgRNA堿基用超純水按1:200稀釋,并與回收后的載體進行連接;

  8. 連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化,氨芐抗性固體培養(yǎng)板進行涂板;

  9. 挑取單克隆菌落,擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,并使用human U6通用引物對連接載體進行測序,檢測sgRNA 堿基片段是否正確插入px330質(zhì)粒。


圖1.px330 sgRNA表達載體構(gòu)建示意圖

然而,在進行受精卵顯微注射時為了增加基因編輯的效率,一般以RNA形式替代DNA質(zhì)粒形式。以下為構(gòu)建sgRNA體外轉(zhuǎn)錄載體pGS3-T7-sgRNA步驟。(圖2)
  1. 確定20bp sgRNA靶序列,按上述操作將其連接至BbsI酶切的pGS3-T7-sgRNA中,測序并挑選正確插入的質(zhì)粒;

  2. pGS3-T7-sgRNA質(zhì)粒線性化:用DraI酶切1μg pGS3-T7-sgRNA質(zhì)粒,37℃反應(yīng)3h;

  3. 以構(gòu)建正確的pGS3-T7-sgRNA為模板,配制體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液(體系見表1);

  4. 將上述溶液均勻混合后輕微離心,將轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液收集于反應(yīng)管底部,42℃反應(yīng) 2 小時;

  5. 加3μl RNase-Free DNase I至20μl反應(yīng)體系中,充分混合后置于37℃反應(yīng)30min;

  6. 加77μl RNase-free 純水以終止反應(yīng)繼續(xù)進行;

  7. 使用酚氯仿和異丙醇方法純化轉(zhuǎn)錄后的RNA;

  8. 取反應(yīng)液的一部分進行4% 瓊脂糖凝膠電泳,確認體外轉(zhuǎn)錄后的 RNA 產(chǎn)物;

  9. 測定RNA濃度,用以顯微注射。 


    圖2. pGS3-T7-sgRNA載體構(gòu)建及體外轉(zhuǎn)錄示意圖

    試劑

    用量

    Transcription buffer ,10 x

    2μl

    Template DNA ,200ng/μl

    5μl

    ATP ,50mM

    2μl

    GTP ,50mM

    2μl

    CTP ,50mM

    2μl

    UTP ,50mM

    2μl

    Rnase inhibitor ,40U

    0.5μl

    RNA polymerase , 50U

    2μl

    RNase-free H2O

    2.5μl

表1. sgRNA T7-體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

Cas9表達載體體外轉(zhuǎn)錄步驟。(圖3)

  1. pSP6-Cas9質(zhì)粒線性化:用NotI單酶切5μg pSP6-Cas9質(zhì)粒,37℃反應(yīng)5h;

  2. 0.8%或1%瓊脂糖凝膠電泳,并進行DNA凝膠純化回收,測定濃度;

  3. 以純化DNA為模板,按mMessage mMachine SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制反應(yīng)溶液(體系見表2);

  4. 將上述溶液均勻混合后輕微離心,將轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液收集于反應(yīng)管底部,37℃反應(yīng) 2 h;

  5. 加1μl TURBO DNase至反應(yīng)溶液中,混勻并在37℃反應(yīng)15min;

  6. 加30μl nuclease-free 純水及30μl 氯化鋰溶液,混勻溶液并在-20℃冷凍30min;

  7. 4℃、14,000g離心10min以沉淀mRNA,小心去除上清溶液。并用500μl 70%乙醇清洗一遍,同時再次4℃、14,000g離心10min;

  8. 吸凈上清乙醇溶液,室溫干燥5min,最后用20μl RNase-free 純水溶解mRNA沉淀,混勻后置冰上并測定濃度,最后置于-80℃或-150℃保存。

 

圖3. pSP6-Cas9載體構(gòu)建及體外轉(zhuǎn)錄示意圖

試劑

用量

Transcription buffer ,10 x

2μl

Template DNA ,200ng/μl

5μl

SP6 NTP/CAP ,2 x

2μl

SP6 enzyme mix

2μl

RNase-free H2O

9μl

表2. Cas9 mRNA SP6-體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

參考文獻:

Shao Y et al., CRISPR/Cas-mediated genomeediting in the rat via direct injection of one-cell embryos. Nat Protoc. 2014Oct;9(10):2493-512.

來源:上海邦耀生物科技有限公司
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