Nature Cell Biology：外泌體LncRNA幫助免疫細胞“叛變”----乳腺癌惡化新機制！
文章導(dǎo)讀：
外泌體是細胞間傳遞信號的媒介，直徑在30-200nm，表面具有磷脂雙分子層，內(nèi)部具有豐富內(nèi)含物的小囊泡，其內(nèi)含物包括miRNA，環(huán)狀RNA，LncRNA和mRNA等。以不久前發(fā)表于Nature Cell Biology（影響因子：19）的文章為例，看一看外泌體中LncRNA的功能機制是如何研究的。
本篇文章由中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院宋爾衛(wèi)、蘇士成團隊聯(lián)合發(fā)表，首次揭示了腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）通過分泌外泌體包裹的LncRNA調(diào)控腫瘤細胞糖代謝過程。為了找到外泌體中特有且高表達的LncRNA，本文作者借助外泌體LncRNA測序，對TAM及對照組細胞分泌的外泌體和相關(guān)細胞分別進行測序，找到了在外泌體中特異性高表達的LncRNA HISLA。通過外泌體與腫瘤細胞共培養(yǎng)、RNA Pull Down、RIP、ChIP等手段，揭示了LncRNA HISLA通過抑制轉(zhuǎn)錄因子HIF-1a與PHD2蛋白結(jié)合來保證HIF-1a穩(wěn)定性，即而維持腫瘤細胞有氧狀態(tài)在HIF-1a信號的持續(xù)激活。反過來，處于顯著無氧糖酵解狀態(tài)的腫瘤細胞可分泌大量的乳酸分子，乳酸作用于巨噬細胞可顯著上調(diào)巨噬細胞中HISLA表達，從而維持巨噬細胞來源的外泌體中HISLA的高豐度裝載。
外泌體是細胞間傳遞信號的媒介，直徑在30-200nm，表面具有磷脂雙分子層，內(nèi)部具有豐富內(nèi)含物的小囊泡，其內(nèi)含物包括miRNA，環(huán)狀RNA，LncRNA和mRNA等。以不久前發(fā)表于Nature Cell Biology（影響因子：19）的文章為例，看一看外泌體中LncRNA的功能機制是如何研究的。
本篇文章由中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院宋爾衛(wèi)、蘇士成團隊聯(lián)合發(fā)表，首次揭示了腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）通過分泌外泌體包裹的LncRNA調(diào)控腫瘤細胞糖代謝過程。為了找到外泌體中特有且高表達的LncRNA，本文作者借助外泌體LncRNA測序，對TAM及對照組細胞分泌的外泌體和相關(guān)細胞分別進行測序，找到了在外泌體中特異性高表達的LncRNA HISLA。通過外泌體與腫瘤細胞共培養(yǎng)、RNA Pull Down、RIP、ChIP等手段，揭示了LncRNA HISLA通過抑制轉(zhuǎn)錄因子HIF-1a與PHD2蛋白結(jié)合來保證HIF-1a穩(wěn)定性，即而維持腫瘤細胞有氧狀態(tài)在HIF-1a信號的持續(xù)激活。反過來，處于顯著無氧糖酵解狀態(tài)的腫瘤細胞可分泌大量的乳酸分子，乳酸作用于巨噬細胞可顯著上調(diào)巨噬細胞中HISLA表達，從而維持巨噬細胞來源的外泌體中HISLA的高豐度裝載。
路線圖：
框中涉及實驗技術(shù)，云序提供一站式服務(wù)
理解重點：
1.TAM是一種癌癥相關(guān)巨噬細胞。在遇到癌癥細胞后，職能發(fā)生180度大轉(zhuǎn)變，成為癌細胞的“幫兇”，參與癌細胞促生長，遷移等過程。目前已發(fā)現(xiàn)，TAM中LncRNA能夠以外泌體為媒介參與鄰近癌細胞糖酵解的過程。本文想深入探究其中的機制。本文對照組：外周血中分離的一種單核巨噬細胞（MDM）。
2. HIF-1α是一種氧傳感轉(zhuǎn)錄因子，能夠決定葡萄糖的代謝途徑是氧化還是糖酵解（無氧）。HIF-1α首先被PHD2羥基化，然后被降解。在本文中發(fā)現(xiàn)，LncRNA HISLA競爭性與PHD2結(jié)合，從而防止HIF-1α降解，達到增強腫瘤細胞有氧糖酵解。
3. 葡萄糖作為能量代謝的原料，主要通過有氧或無氧（又叫糖酵解）方式代謝產(chǎn)能。而腫瘤細胞在有氧條件下發(fā)生的糖酵解，產(chǎn)生大量中間產(chǎn)物：乳酸。
1.TAM是一種癌癥相關(guān)巨噬細胞。在遇到癌癥細胞后，職能發(fā)生180度大轉(zhuǎn)變，成為癌細胞的“幫兇”，參與癌細胞促生長，遷移等過程。目前已發(fā)現(xiàn)，TAM中LncRNA能夠以外泌體為媒介參與鄰近癌細胞糖酵解的過程。本文想深入探究其中的機制。本文對照組：外周血中分離的一種單核巨噬細胞（MDM）。
2. HIF-1α是一種氧傳感轉(zhuǎn)錄因子，能夠決定葡萄糖的代謝途徑是氧化還是糖酵解（無氧）。HIF-1α首先被PHD2羥基化，然后被降解。在本文中發(fā)現(xiàn)，LncRNA HISLA競爭性與PHD2結(jié)合，從而防止HIF-1α降解，達到增強腫瘤細胞有氧糖酵解。
3. 葡萄糖作為能量代謝的原料，主要通過有氧或無氧（又叫糖酵解）方式代謝產(chǎn)能。而腫瘤細胞在有氧條件下發(fā)生的糖酵解，產(chǎn)生大量中間產(chǎn)物：乳酸。
正文部分：
1.TAM促進有氧糖酵解和抑制乳腺癌細胞凋亡過程
借助免疫組化，通過GLUT3和CD63抗體標記乳腺癌組織，發(fā)現(xiàn)糖酵解與TAM相關(guān)。為了實驗準確性，將每組8例樣本量擴大到453例，從而得到了同樣趨勢，說明TAM與有氧糖酵解存在很大聯(lián)系。通過體外共培養(yǎng)實驗，進一步研究TAM調(diào)控腫瘤有氧糖酵解過程機理，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞與從組織中分離的原代TAM共培養(yǎng)后，能夠顯著提高糖酵解水平（檢測指標包括：細胞外酸化程度，葡萄糖消耗量和乳酸量，糖酵解途徑蛋白marker）。同時，發(fā)生有氧糖酵解細胞的凋亡能力往往很低。 
2.TAM激活HIF-1α參與促進有氧糖酵解和抑制細胞凋亡
已有研究報道HIF-1α可促進有氧糖酵解過程。作者將乳腺癌細胞與TAM共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白高表達，并且找到了高表達的原因在于其半衰期很長。同時，HIF-1α與有氧糖酵解水平呈正比（檢測指標同一）。并且，HIF-1α抑制細胞凋亡。
已有研究報道HIF-1α可促進有氧糖酵解過程。作者將乳腺癌細胞與TAM共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白高表達，并且找到了高表達的原因在于其半衰期很長。同時，HIF-1α與有氧糖酵解水平呈正比（檢測指標同一）。并且，HIF-1α抑制細胞凋亡。
3. 高通量測序篩選在TAM外泌體中高表達LncRNA
TAM主要研究領(lǐng)域是它們與其他類型細胞間傳遞遺傳信息的機制，那外泌體是否是其中的媒介呢？為了解決這個問題，本文對乳腺癌細胞上清提取的外泌體進行了LncRNA高通量測序，測序組別為三組，分別是TAM與MDM（TAM的對照組細胞）提取的巨噬細胞，TAM與MDM細胞上清提取的外泌體，乳腺癌細胞與TAM共培養(yǎng)細胞與未做處理乳腺癌細胞（對照組）。在TAM外泌體組中找到88個與MDM外泌體相比差異上調(diào)的LncRNA。一切高通量手段都要通過低通量手段驗證，作者借助LncRNA定量PCR檢測了7個指標，其中有5個指標與測序結(jié)果一致。
TAM主要研究領(lǐng)域是它們與其他類型細胞間傳遞遺傳信息的機制，那外泌體是否是其中的媒介呢？為了解決這個問題，本文對乳腺癌細胞上清提取的外泌體進行了LncRNA高通量測序，測序組別為三組，分別是TAM與MDM（TAM的對照組細胞）提取的巨噬細胞，TAM與MDM細胞上清提取的外泌體，乳腺癌細胞與TAM共培養(yǎng)細胞與未做處理乳腺癌細胞（對照組）。在TAM外泌體組中找到88個與MDM外泌體相比差異上調(diào)的LncRNA。一切高通量手段都要通過低通量手段驗證，作者借助LncRNA定量PCR檢測了7個指標，其中有5個指標與測序結(jié)果一致。
4. TAM外泌體中LncRNA HISLA促進糖酵解
通過前期高通量測序，找到在三組中都高表達的LncRNA HISLA。將其敲除后，促進了外泌體的分泌。更有趣的是，在與TAM共培養(yǎng)前，抑制乳腺癌細胞中LncRNA HISLA基因能夠抑制糖酵解。并通過RNA聚合酶II和III特異性抑制劑：α-amanitin證實，TAM外泌體未影響腫瘤細胞本身LncRNA轉(zhuǎn)錄過程，所以受體細胞中LncRNA HISLA增加主要是由于TAM外泌體中帶來的。為了觀察外泌體中LncRNA HISLA的形成軌跡，作者在基因上加上生物素標簽，通過動態(tài)共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)LncRNA HISLA主要由核內(nèi)體RAB7分泌而來。
通過前期高通量測序，找到在三組中都高表達的LncRNA HISLA。將其敲除后，促進了外泌體的分泌。更有趣的是，在與TAM共培養(yǎng)前，抑制乳腺癌細胞中LncRNA HISLA基因能夠抑制糖酵解。并通過RNA聚合酶II和III特異性抑制劑：α-amanitin證實，TAM外泌體未影響腫瘤細胞本身LncRNA轉(zhuǎn)錄過程，所以受體細胞中LncRNA HISLA增加主要是由于TAM外泌體中帶來的。為了觀察外泌體中LncRNA HISLA的形成軌跡，作者在基因上加上生物素標簽，通過動態(tài)共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)LncRNA HISLA主要由核內(nèi)體RAB7分泌而來。
5.腫瘤缺氧微環(huán)境中乳酸在TAM中上調(diào)LncRNA
通過生信軟件預(yù)測LncRNA HISLA基因啟動子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子PU.1有典型結(jié)合位點。接著，借助ChIP qPCR實驗證實兩者是直接結(jié)合的。作者又發(fā)現(xiàn)LncRNA HISLA在TAM中的表達量遠高于其他巨噬細胞MDM，已有研究表明MDM“策反”為TAM細胞期間，細胞中性粒細胞集落刺激因子和乳酸會差異表達，檢測后發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致LncRNA HISLA上調(diào)的主要原因是乳酸。更有趣的是，作者在TAM中發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達量與LncRNA HISLA相關(guān)，并且LncRNA HISLA能夠影響有氧糖酵解的生理表型。總的來說，乳酸在腫瘤缺氧微環(huán)境中起正反饋作用。
通過生信軟件預(yù)測LncRNA HISLA基因啟動子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子PU.1有典型結(jié)合位點。接著，借助ChIP qPCR實驗證實兩者是直接結(jié)合的。作者又發(fā)現(xiàn)LncRNA HISLA在TAM中的表達量遠高于其他巨噬細胞MDM，已有研究表明MDM“策反”為TAM細胞期間，細胞中性粒細胞集落刺激因子和乳酸會差異表達，檢測后發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致LncRNA HISLA上調(diào)的主要原因是乳酸。更有趣的是，作者在TAM中發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達量與LncRNA HISLA相關(guān)，并且LncRNA HISLA能夠影響有氧糖酵解的生理表型。總的來說，乳酸在腫瘤缺氧微環(huán)境中起正反饋作用。
6. HISLA通過干擾PHD2與HIF-1α結(jié)合從而維持HIF-1α穩(wěn)定
當(dāng)乳腺癌細胞與TAM或TAM外泌體共培養(yǎng)時，細胞的羥甲基化和退化都收到了抑制，而此過程可能與HIF-1α的羥甲基化和退化有關(guān)。RNA pull down和RIP實驗證實LncRNA HISLA與PHD2（HIF-1α的羥甲基化和退化指示蛋白）是直接結(jié)合的關(guān)系。Fish實驗證實兩者主要結(jié)合在細胞質(zhì)。
當(dāng)乳腺癌細胞與TAM或TAM外泌體共培養(yǎng)時，細胞的羥甲基化和退化都收到了抑制，而此過程可能與HIF-1α的羥甲基化和退化有關(guān)。RNA pull down和RIP實驗證實LncRNA HISLA與PHD2（HIF-1α的羥甲基化和退化指示蛋白）是直接結(jié)合的關(guān)系。Fish實驗證實兩者主要結(jié)合在細胞質(zhì)。
7. LncRNA HISLA與乳腺癌糖代謝和化療耐受相關(guān)
為驗證本次研究成果與臨床的相關(guān)性，作者以453個乳腺癌患者為樣本，檢測LncRNA HISLA表達量與腫瘤糖代謝關(guān)鍵基因（GLUT1，GLUT3，HK2）以及TAM的marker：CD68抗原。結(jié)果顯示LncRNA HISLA在TAM中廣泛表達，檢出率為33%，同時表達量與TAM的浸潤面積相關(guān)。重要的是，LncRNA HISLA在患者血液外泌體和組織樣本中表達量相關(guān)，且都與TAM相關(guān)。表明在乳腺患者體內(nèi)的TAM通過抑制LncRNA HISLA表達，從而增強腫瘤糖酵解過程。另外，作者將LncRNA HISLA表達情況與臨床病理關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)高表達組與疾病的分級、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HER2亞型相關(guān)。并且表達量與GLUT3高表達，患者較差生存情況相關(guān)�？偟膩碚f，LncRNA HISLA在乳腺癌化療耐藥方面可作為理想的分子標志物。
為驗證本次研究成果與臨床的相關(guān)性，作者以453個乳腺癌患者為樣本，檢測LncRNA HISLA表達量與腫瘤糖代謝關(guān)鍵基因（GLUT1，GLUT3，HK2）以及TAM的marker：CD68抗原。結(jié)果顯示LncRNA HISLA在TAM中廣泛表達，檢出率為33%，同時表達量與TAM的浸潤面積相關(guān)。重要的是，LncRNA HISLA在患者血液外泌體和組織樣本中表達量相關(guān)，且都與TAM相關(guān)。表明在乳腺患者體內(nèi)的TAM通過抑制LncRNA HISLA表達，從而增強腫瘤糖酵解過程。另外，作者將LncRNA HISLA表達情況與臨床病理關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)高表達組與疾病的分級、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HER2亞型相關(guān)。并且表達量與GLUT3高表達，患者較差生存情況相關(guān)�？偟膩碚f，LncRNA HISLA在乳腺癌化療耐藥方面可作為理想的分子標志物。
總結(jié)：
本文首先通過外泌體LncRNA測序證實TAM通過分泌外泌體中LncRNA促進乳腺癌細胞糖酵解過程。借助分子間相互作用的機制實驗，如RNA Pull Down，RIP，ChIP等證實LncRNA HISLA可通過結(jié)合PHD2蛋白從而維持HIF-1α穩(wěn)定。同時，癌細胞分泌乳酸對TAM中LncRNA HISLA具有上調(diào)作用，從而形成了正反饋。臨床大樣本數(shù)據(jù)結(jié)果證實LncRNA HISLA在TAM中表達，并且與乳腺癌患者糖酵解、化療效果差異和生存期長短相關(guān)�？偟膩碚f，本研究發(fā)現(xiàn)了腫瘤細胞分泌細胞外囊泡所攜帶LncRNA具有促進腫瘤糖酵解作用。
全文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41556-019-0299-0
https://doi.org/10.1038/s41556-019-0299-0
往期回顧：
云序客戶13分頂級文章，揭示糖尿病血小板來源miRNA參與海綿機制介導(dǎo)動脈損傷修復(fù)
賀云序客戶發(fā)表首篇腦創(chuàng)傷外泌體環(huán)狀RNA文章！
云序客戶12分頂級文章，教你如何巧用RIP測序玩轉(zhuǎn)分子機制！
云序生物客戶最新文章：ChIP-seq&mRNA-seq聯(lián)合應(yīng)用
Nature子刊|云序生物聯(lián)合南京醫(yī)科大發(fā)表重要研究成果：揭示lncRNA促進胃癌進展的新機制
泌尿外科最權(quán)威白金期刊European Urology：首次揭示Y染色體上LncRNA TTTY15
上海云序生物科技有限公司
Shanghai Cloud-seq Biotech Co., Ltd.
地址：上海市松江區(qū)莘磚公路518號20號樓3樓
電話：021-64878766
傳真：021-64878766
網(wǎng)址：www.cloud-seq.com.cn
郵箱：market@cloud-seq.com.cn
- 空間和單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)綜合分析揭示與不良預(yù)后相關(guān)的中間癌細胞群
- 單細胞測序助力揭示右心室容量超荷會通過免疫反應(yīng)重啟心肌細胞的增殖
- BS+ChIP-seq在揭示DNA甲基化調(diào)控非編碼RNA抑制腫瘤侵襲性中的應(yīng)用
- 靶基因甲基化測序(Target-BS)等在揭示特應(yīng)性皮炎新發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用
- ChIP等揭示糖皮質(zhì)激素和TET2共調(diào)控促進癌癥轉(zhuǎn)移的表觀遺傳機制
- 游離細胞DNA（cfDNA）檢測整體研究方案及其應(yīng)用案例
- DNA甲基化修飾整體研究方案技術(shù)介紹及經(jīng)典案例分析
- DNA甲基化詳解
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com