文章導(dǎo)讀
眾所周知，運(yùn)動(dòng)可以降低心血管疾病的發(fā)生概率。目前已有的研究報(bào)道主要集中在肌肉因子方面，因?yàn)樗�具有旁分泌和�?nèi)分泌作用，能夠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)的多系統(tǒng)效應(yīng)。然而，運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟保護(hù)作用的潛在機(jī)制目前尚未可知。第四軍醫(yī)大學(xué)高峰、王立鋒科研團(tuán)隊(duì)的最新研究成果表明，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)衍生的循環(huán)外泌體能夠傳遞心臟保護(hù)信號(hào)，并鑒定出外泌體miR-342-5p是一種新的心臟保護(hù)性運(yùn)動(dòng)因子，能夠?qū)�抗大鼠心肌缺血和再灌注（MI/R）引起的損傷。

發(fā)表期刊：Circulation Research
影響因子：15.211
實(shí)驗(yàn)方法：miRNA測(cè)序
實(shí)驗(yàn)材料：長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)的人和大鼠的血漿（實(shí)驗(yàn)組），不運(yùn)動(dòng)的人和大鼠的血漿（對(duì)照組）

本篇文章作者首先收集了運(yùn)動(dòng)和久坐的大鼠的血漿，從中分離出外泌體，運(yùn)動(dòng)大鼠血漿中外泌體為實(shí)驗(yàn)組(exe-exo)，久坐大鼠血漿中外泌體為對(duì)照組(sed-exo)（圖1A），對(duì)外泌體進(jìn)行鏡檢后（圖1B），又檢測(cè)了兩組的外泌體蛋白，結(jié)果顯示兩組間外泌體的量并沒有顯著差異（圖1C），且NTA分析也顯示，兩組的粒徑分布和血漿濃度沒有顯著性差異（圖1D和E）。然后作者用pkh26標(biāo)記的外泌體和心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察到外泌體在孵育6小時(shí)后被心肌細(xì)胞內(nèi)化(圖1F)。

圖1. 運(yùn)動(dòng)和久坐大鼠的外泌體數(shù)量無差異；外泌體能被心肌細(xì)胞內(nèi)化

于是作者對(duì)人做了相同的檢測(cè)。運(yùn)動(dòng)員血漿外泌體為實(shí)驗(yàn)組(Row-exo)和普通人的血漿外泌體為對(duì)照組(Con-exo)，結(jié)果與大鼠一致(圖2K和L)。此外，作者還發(fā)現(xiàn)將運(yùn)動(dòng)員的外泌體和人的心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后，可以降低細(xì)胞凋亡(圖2M)，同時(shí)釋放血清乳酸脫氫酶LDH(圖2O)，并能增加心肌細(xì)胞活力(圖2N)。

圖2. 運(yùn)動(dòng)員和普通人的外泌體數(shù)量也無差異；外泌體也能被心肌細(xì)胞內(nèi)化

2.運(yùn)動(dòng)分泌外泌體（exe-exo）對(duì)MI/R損傷有心肌保護(hù)作用
首先作者對(duì)兩組大鼠進(jìn)行心肌缺血30 分鐘，再灌注24小時(shí)的損傷破壞，發(fā)現(xiàn)與久坐對(duì)照組(sed)相比，運(yùn)動(dòng)組(exe)大鼠心肌梗死面積減少，LDH降低，表明運(yùn)動(dòng)對(duì)MI/R損傷有明顯的心肌保護(hù)作用。

為研究運(yùn)動(dòng)分泌的外泌體對(duì)心肌保護(hù)的作用，作者從兩組大鼠的等體積血漿中分離出外泌體，并在MI/R損傷前的48小時(shí)，將攜帶pkh26標(biāo)記的外泌體注射進(jìn)正常大鼠心肌。接著對(duì)大鼠進(jìn)行MI/R損傷，24小時(shí)后發(fā)現(xiàn)，與注射sed-exo的大鼠相比，注射exe-exo的大鼠心臟梗死面積顯著減小(圖3A)，同時(shí)伴有LDH降低。此外，作者還發(fā)現(xiàn)注射exe-exo的大鼠心臟功能得到改善，如MI/R后保留射血分?jǐn)?shù)和分?jǐn)?shù)縮短4周（圖3F-H）。綜上，exe-exo對(duì)MI/R損傷具有心肌保護(hù)作用。

圖3. Exe-exo能減少M(fèi)I/R損傷導(dǎo)致的心肌梗死面積，改善心臟功能

3.miR-342-5p是exe-exo中誘導(dǎo)心臟保護(hù)的關(guān)鍵成分
為了探討miRNA在外泌體誘導(dǎo)的心臟保護(hù)中發(fā)揮作用的可能性，作者分別對(duì)兩組大鼠外泌體中的miRNA進(jìn)行了高通量測(cè)序（云序可以提供此服務(wù)）。共檢測(cè)到14個(gè)差異表達(dá)的miRNAs(圖4A)，經(jīng)q-PCR分析進(jìn)一步驗(yàn)證后，確定12個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中11個(gè)表達(dá)上調(diào)(圖4B)。接著作者用缺氧/復(fù)氧（H/R）模型研究這11種上調(diào)的miRNAs如何影響心肌細(xì)胞的功能。發(fā)現(xiàn)miR-342-5p能顯著降低H/R作用下心肌細(xì)胞的凋亡，降低LDH的釋放，提高細(xì)胞活力(圖4C-E)。

為了更好地了解外泌體miR-342-5p的功能，作者又檢測(cè)了血漿外泌體處理的心肌細(xì)胞和心臟中miR-342-5p及其前體的水平。心肌細(xì)胞經(jīng)exe-exo孵育和心臟注射48小時(shí)后，其中的miR-342-5p水平顯著升高(圖4G)，而前體m iR-342-5p水平無明顯變化，表明exe-exo將miR-342-5p傳遞給心肌細(xì)胞或心臟。此外，抑制miR-342-5p可以明顯減弱運(yùn)動(dòng)型血漿外泌體對(duì)心臟的保護(hù)作用(圖4H-J)。這些結(jié)果表明miR-342-5p在外泌體誘導(dǎo)的心臟保護(hù)中起著關(guān)鍵的作用。

于是作者檢測(cè)了運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練前后血漿外泌體中的miR-342-5p含量，發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練后它的表達(dá)量比未受訓(xùn)的時(shí)候提高了1.8倍(圖4F)。

圖4. miR-342-5p在exe-exo提供的心臟保護(hù)中起關(guān)鍵作用

4.miR-342-5p通過靶向結(jié)合心肌細(xì)胞中的Caspase 9和Jnk2發(fā)揮抗凋亡作用
為進(jìn)一步研究miR-342-5p的作用機(jī)制，作者預(yù)測(cè)了miR-342-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)Caspase3、Caspase9和Jnk2能參與MI/R損傷和凋亡途徑(圖5A)。接著作者又發(fā)現(xiàn)增加miR-342-5p后，可以顯著降低Caspase9和Jnk2的蛋白水平，反之亦然，但沒有觀察到Caspase3基因表達(dá)的顯著改變(圖5B)。接著作者用熒光素酶進(jìn)一步研究了Caspase9和Jnk2兩個(gè)基因與miR-342-5p的結(jié)合位點(diǎn)(圖5C)。此外，exe-exo孵育可以顯著抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞裂解-Caspase3、裂解-Caspase9和磷酸(P)-Jnk2的表達(dá)(圖5D)。綜上，這些數(shù)據(jù)表明miR-342-5p通過靶向結(jié)合Caspase9和Jnk2，在心肌細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡作用。

圖5. miR-342-5p通過結(jié)合心肌細(xì)胞中的Caspase 9和Jnk2發(fā)揮抗凋亡作用

5.miR-342-5p通過靶向結(jié)合Ppm1f增強(qiáng)心肌細(xì)胞中AKT的磷酸化
生存信號(hào)AKT和ERK 1/2已被證實(shí)為心臟保護(hù)的關(guān)鍵分子。miR-342-5p可以上調(diào)心肌細(xì)胞中AKT的磷酸化，而ERK 1/2的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化(圖6A)；在H/R心肌細(xì)胞中觀察到類似的現(xiàn)象(圖6B-D)。這些結(jié)果表明，miR-342-5p能激活心肌細(xì)胞的生存信號(hào)AKT。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)Ppm1f是miR-342-5p的潛在靶點(diǎn)，這是生信分析預(yù)測(cè)的唯一磷酸酶（圖6E）。如圖6F所示，miR-342-5p可以減少Ppm1f蛋白水平，反之亦然。熒光素酶報(bào)告分析進(jìn)一步證實(shí)miR-342-5p可以直接結(jié)合Ppm1f的3'UTR區(qū)(圖6G)。值得注意的是，下調(diào)Ppm1f蛋白表達(dá)不僅顯著提高AKT的磷酸化水平(圖6H-I)，還可以降低H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡(圖6J)，這暗示AKT磷酸化水平升高可能在心肌保護(hù)中發(fā)揮作用。

圖6. miR-342-5p靶向結(jié)合Ppm1f，增強(qiáng)心肌細(xì)胞中AKT的磷酸化

6.內(nèi)皮細(xì)胞是運(yùn)動(dòng)分泌外泌體中miR-342-5p的主要來源
為探討長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)引起的大鼠循環(huán)外體miR-342-5p增加的原因，作者檢測(cè)了大鼠心臟、骨骼肌、主動(dòng)脈、肝臟、脂肪組織、腎臟、脾臟和血漿中成熟miR-342-5p及其前體的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)成熟miR-342-5p在多個(gè)組織中均有表達(dá)(圖7A)。而運(yùn)動(dòng)后，這些組織中的成熟miR-342-5p和前體miR-342-5p的量均顯著增加，出乎意料的是，它們的增加主要發(fā)生在主動(dòng)脈而不是骨骼肌或心肌細(xì)胞中(圖7B-C)。進(jìn)一步研究表明，去除主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞后，成熟miR-342-5p和前體miR-342-5p的量可明顯降低，暗示內(nèi)皮細(xì)胞是主動(dòng)脈miR-342-5p的主要來源(圖7D)。接著，作者從運(yùn)動(dòng)大鼠和久坐大鼠中分離出主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)顯著增加了內(nèi)皮細(xì)胞中成熟的miR-342-5p和前體miR-342-5p(圖7E)。此外，電鏡發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)中存在典型的多囊體(MVBS)，MVBS與質(zhì)膜融合，釋放外泌體進(jìn)入循環(huán)(圖7F)。這些結(jié)果提示血管內(nèi)皮細(xì)胞是運(yùn)動(dòng)引起的外泌體中miR-342-5p的重要來源。

接下來，作者研究了內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體是否能被心肌細(xì)胞所吸收。作者用cy3標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體，并將其添加到人的心肌細(xì)胞中(圖7G)。共聚焦成像證實(shí)了cy3標(biāo)記的miRNAs可以從內(nèi)皮細(xì)胞向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)(圖7H)。將cy3標(biāo)記的外泌體與心肌細(xì)胞共同孵育，結(jié)果表明，受體心肌細(xì)胞中miR-342-5p增加(圖7I)。更重要的是，受體心肌細(xì)胞在H/R損傷后凋亡減少(圖7J)。綜上，這些結(jié)果表明內(nèi)皮細(xì)胞釋放的mi-342-5p不僅可以被心肌細(xì)胞所吸收，而且可以保護(hù)心肌細(xì)胞免受H/R損傷。

7.層切應(yīng)力(LSS)刺激可以上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞miR-342-5p的表達(dá)
血流誘導(dǎo)的LSS是一種與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的生理刺激物，被認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞適應(yīng)的中樞信號(hào)機(jī)制。為了研究LSS對(duì)miR-342-5p產(chǎn)生的影響，作者將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，分別置于靜止條件和LSS條件中培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)LSS不僅增加了細(xì)胞中成熟的miR-342-5p和pre-miR-342-5p(圖7K)，而且增加了外泌體miR-342-5p的分泌(圖7L)。這表明運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的LSS可以直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放miR-342-5p。

圖7. 內(nèi)皮細(xì)胞是運(yùn)動(dòng)分泌外泌體中miR-342-5p的主要來源；
miR-342-5p可以被心肌細(xì)胞吸收，并保護(hù)心肌細(xì)胞免受H/R損傷；
LSS可以直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放miR-342-5p

8.miR-342-5p在體內(nèi)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心臟保護(hù)中起著不可或缺的作用
為了探討體內(nèi)miR-342-5p在運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心臟保護(hù)中的作用，作者使用帶有特定序列的病毒(AAV9)來抑制大鼠心臟中的miR-342-5p。游泳訓(xùn)練前一周，在大鼠心肌內(nèi)注射AAV-anti-miR-342-5p或AAV陰性對(duì)照(圖8A)，在訓(xùn)練24小時(shí)后檢測(cè)到轉(zhuǎn)染AAV9。如圖8所示，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以增加心臟中的miR-342-5p(圖8B)，同時(shí)減少Caspase 9、Jnk 2和Ppm1f表達(dá)，增強(qiáng)AKT的磷酸化；而降低miR-342-5p可減輕這些變化(圖8C)。重要的是，運(yùn)動(dòng)后，MI/R損傷導(dǎo)致的大鼠心肌梗死面積(圖8D-E)和心肌細(xì)胞凋亡(圖8F-G)明顯減少，降低miR-342-5p后，這種情況顯著減弱(圖8D-G)。在MI/R損傷前48小時(shí)注射miR-342-5p，可以顯著升高大鼠心臟的miR-342-5p表達(dá)水平(圖8H)，縮小心肌梗死范圍(圖8I)。綜上，這些體內(nèi)數(shù)據(jù)表明，在長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心臟保護(hù)中，miR-342-5p對(duì)抵抗MI/R損傷起著至關(guān)重要的作用。

圖8. 在運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心臟保護(hù)中，miR-342-5p對(duì)抵抗MI/R損傷起重要作用

總結(jié)：
長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)衍生的循環(huán)外泌體，雖然其血漿水平?jīng)]有顯著變化，但對(duì)MI/R損傷提供了深遠(yuǎn)和持續(xù)的心臟保護(hù)。作者發(fā)現(xiàn)外體miR-342-5p是抑制凋亡信號(hào)(Caspase9和Jnk2)，增強(qiáng)心臟存活信號(hào)(P-Akt)的關(guān)鍵心臟保護(hù)分子。血管內(nèi)皮細(xì)胞可能是外泌體miR-342-5p的主要來源，表明在運(yùn)動(dòng)提供的心臟保護(hù)中，血管與心臟之間的相互干擾。這些發(fā)現(xiàn)揭示了運(yùn)動(dòng)給予心肌保護(hù)可以作為一種新型的心肌保護(hù)作用機(jī)制，突出了miR-342-5p在缺血性心臟病預(yù)防和康復(fù)中的治療潛力。

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全文鏈接：
https://www.ahajournals.org/doi/abs/10.1161/CIRCRESAHA.118.314635

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