血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）在健康狀態(tài)下處于去分化表型，在其受損時(shí)，循環(huán)系統(tǒng)中的血小板快速激活，通過凝血反應(yīng)為受傷部位止血，同時(shí)對創(chuàng)傷部位釋放PDGF、血栓烷等生物活性介質(zhì)，使VSMC切換為高分化表型，同時(shí)細(xì)胞處于促增殖狀態(tài)。血管內(nèi)膜增生型糖尿病就是由于VSMC分化和去分化狀態(tài)切換機(jī)制失調(diào)引起的。然而，這類疾病的分子機(jī)制還不清楚。

云序生物攜手廣州市婦女兒童醫(yī)療中心科研團(tuán)隊(duì)首次揭示血小板中miR-223通過調(diào)控靶基因表達(dá)從而介導(dǎo)創(chuàng)傷修復(fù)過程，同時(shí)建立了糖尿病分子機(jī)制模型，為日后細(xì)胞損傷修復(fù)過程提供了參考依據(jù)。

發(fā)表期刊：Journal of Clinical Investigation
影響因子：13.3
實(shí)驗(yàn)方法：AGO2 RIP實(shí)驗(yàn)，miRNA測序
實(shí)驗(yàn)材料：VSMC與血小板共培養(yǎng)組（實(shí)驗(yàn)組），VSMC未處理組（空白組）；模型小鼠等

1.活化血小板促進(jìn)人類VSMC分化增殖
首先，本篇文章作者以人類VSMC與活化血小板共培養(yǎng)的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組（AP），未做處理的細(xì)胞為空白對照組（RP），進(jìn)行qPCR和WB檢測，結(jié)果顯示共培養(yǎng)組細(xì)胞內(nèi)與分化相關(guān)的marker顯著表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞增殖能力減弱，這與常理相反。接著，作者從體外和體內(nèi)角度分別借助共聚焦顯微鏡觀測到VSMC能夠分泌血小板。那么問題來了，血小板是否會(huì)攜帶其他分子動(dòng)態(tài)的參與到分化過程呢？

   

圖1. 分化相關(guān)蛋白WB結(jié)果；共聚焦顯微鏡觀測VSMC能夠自主分泌血小板

2.血小板攜帶miRNA進(jìn)入VSMC并參與分化過程
帶著前面的問題，作者通過查閱文獻(xiàn)，了解到前人曾經(jīng)報(bào)道過血小板中富含大量的miRNA。那是否是由于血小板中的miRNA參與了細(xì)胞的分化呢？接下來的實(shí)驗(yàn)就變的簡單了，借助高通量miRNA測序手段（云序生物miRNA測序服務(wù)）對比共培養(yǎng)細(xì)胞和未處理組細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA。測序結(jié)果檢測到3個(gè)與研究顯著相關(guān)的miRNA：分別為miR-223和miR-143/145。借助miRNA定量PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)三者都在共培養(yǎng)細(xì)胞中高表達(dá)，其中miR-223在共培養(yǎng)8h時(shí)高表達(dá)，miR-143/145在共培養(yǎng)24h時(shí)高表達(dá)。那知道了這三者在時(shí)間軸上的表達(dá)模式，它們發(fā)揮了什么樣的機(jī)制呢？于是，作者借助AGO2 RIP實(shí)驗(yàn)（云序生物提供此項(xiàng)服務(wù)）在實(shí)驗(yàn)組中拉取與AGO2蛋白直接結(jié)合的miRNA，通過miRNA 定量PCR，證實(shí)以上三個(gè)miRNA能夠直接與AGO2蛋白結(jié)合，參與了海綿機(jī)制，并且也證實(shí)血小板分泌的miRNA的確是起活性的。

          

圖2. miRNA高通量測序聚類圖；
miRNA定量PCR表明三者在共培養(yǎng)細(xì)胞中差異高表達(dá)

圖3. AGO2 RIP-miRNA 定量PCR證實(shí)以上三個(gè)miRNA參與了海綿機(jī)制

通過生信分析，預(yù)測與miRNA結(jié)合力最強(qiáng)的靶基因：KLF4，KLF5和PDGFRβ。當(dāng)然，前面都是推測，作者通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者是直接結(jié)合關(guān)系。接下來，作者主要研究了miR-223和PDGFRβ的關(guān)系。對靶基因PDGFRβ進(jìn)行定量PCR后，發(fā)現(xiàn)其在受傷股動(dòng)脈中高表達(dá)，證明創(chuàng)傷能使其表達(dá)量發(fā)生變化。并且，與miR-223表達(dá)量成反比。綜上，說明PDGFRβ的確是miR-223靶基因。

圖4. 生信分析預(yù)測miRNA和靶基因（3’UTR區(qū)）結(jié)合

   
圖5. 熒光定量證實(shí)miRNA和靶基因的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)
 

VSMC分化失常主要會(huì)使人患上血管增生型糖尿病，因此作者希望通過分子手段研究miR-223在糖尿病中發(fā)揮的機(jī)制。miRNA定量PCR結(jié)果顯示，miR-223不管在人還是小鼠的糖尿病組中都是低表達(dá)的模式。那miR-223在細(xì)胞中的定位是如何的呢？通過熒光原位雜交，作者發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的血小板也被內(nèi)化到VSMC中。因此推測，血小板內(nèi)化至細(xì)胞后，引起血小板內(nèi)部miR-223的低表達(dá)，從而促進(jìn)了miRNA靶基因在體內(nèi)的高表達(dá)，最終導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)膜增生的表型。

圖5. 熒光定量證實(shí)miRNA不管在人源還是鼠源都在糖尿病組中低表達(dá)；與靶基因的表達(dá)成反比；
miRNA低表達(dá)促進(jìn)糖尿病患者血管內(nèi)膜增生

5.構(gòu)建VSMC損傷修復(fù)模型
作者首次提出VSMC損傷修復(fù)機(jī)制模型，機(jī)制的參與成員主要包括VSMC、內(nèi)皮組織和血小板，如下圖所示。在未受傷個(gè)體中，內(nèi)皮組織完整，VSMC和血小板間無相互作用。當(dāng)受損時(shí)，內(nèi)皮屏障受損，血小板活化，一方面釋放PDGF，TXA2等物質(zhì)，另一方面攜帶miRNA進(jìn)入VSMC中，提高靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞分化，抑制血管內(nèi)膜增生。但當(dāng)糖尿病患者受損傷時(shí)，血小板在釋放促修復(fù)物質(zhì)方面與前者一致，但在分子機(jī)制上與普通損傷機(jī)制上截然相反。

圖6. 正常和糖尿病組中血小板通過運(yùn)輸miRNA參與VSMC功能

總結(jié)：
本篇文章作者首先將血小板和VSMC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分化情況與常理相反的現(xiàn)象。由此推測血小板中的miRNA在起作用。推斷依據(jù)是：1. 觀測到血小板是由VSMC內(nèi)化而來。2. 前人研究發(fā)現(xiàn)血小板中含有大量miRNA，為證實(shí)推測結(jié)果，作者通過miRNA高通量測序技術(shù)快速找出可能起作用的miR-223，并通過AGO2 RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-223參與了海綿機(jī)制。借助生信預(yù)測，驗(yàn)證和熒光素酶實(shí)驗(yàn)，找出了靶基因PDGFRβ。最后，推測出VSMC損傷修復(fù)的模型以及糖尿病模型中，作者發(fā)現(xiàn)了相反的機(jī)制，為今后臨床研究帶來了巨大的幫助。云序優(yōu)勢總結(jié)
優(yōu)勢總結(jié)：
值得一提的是，云序生物不僅僅為廣大科研用戶解決測序問題，更提供了機(jī)制解決手段。迄今為止，完成RIP和RNA pull down實(shí)驗(yàn)達(dá)到100+案例，助力廣大科研工作者沖刺高分文章。